丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS5A與細(xì)胞蛋白FKBP38相互作用及對(duì)細(xì)胞凋亡影響的研究.pdf

1、丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS5A與細(xì)胞蛋白FKBP38相互作用及對(duì)細(xì)胞凋亡影響的研究 丙型肝炎病毒(HepatitisCVirus，HCV)是一個(gè)全球性的危害人類健康的重要病原體，感染機(jī)體后極易導(dǎo)致慢性肝炎、并引起肝纖維化、肝硬化、肝壞死，最終導(dǎo)致肝癌。目前對(duì)于丙型肝炎病毒致病機(jī)制的了解仍然非常有限。研究發(fā)現(xiàn)丙型肝炎病毒的致病性除了病毒本身因素外，病毒蛋白與宿主細(xì)胞蛋白的相互作用在其中發(fā)揮重要作用。在組成病毒的結(jié)構(gòu)蛋白(Struc

2、turalProtein)和非結(jié)構(gòu)蛋白中(Non-structuralProtein)，非結(jié)構(gòu)蛋白5A(NS5A)通過(guò)與細(xì)胞蛋白的相互作用在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、抗細(xì)胞凋亡以及其它的一些方面發(fā)揮了重要作用，并且許多相互作用的后果都能維持或促進(jìn)病毒在細(xì)胞內(nèi)的持續(xù)復(fù)制，但其詳細(xì)機(jī)制有待進(jìn)一步明確。本文以NS5A蛋白為釣餌，通過(guò)篩選人胎肝細(xì)胞cDNA基因文庫(kù)，尋找與HCVNS5A蛋白相互作用的細(xì)胞蛋白，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步確認(rèn)NS5A與細(xì)胞蛋白

3、的相互作用并研究其生物學(xué)意義。 首先構(gòu)建了HCVNS5A酵母表達(dá)質(zhì)粒，并利用Ga14酵母雙雜合系統(tǒng)對(duì)人胎肝細(xì)胞cDNA文庫(kù)進(jìn)行篩選。通過(guò)第一輪篩選初步獲得陽(yáng)性候選克隆后，將上述克隆再次分別與NS5A釣餌質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞進(jìn)行第二輪驗(yàn)證，獲得十二個(gè)陽(yáng)性克隆。測(cè)序后通過(guò)Blast檢索發(fā)現(xiàn)這十二個(gè)克隆含有兩個(gè)cDNA序列，分別編碼38kD免疫抑制劑FK506結(jié)合蛋白(38kDimmunosuppressantFK506-binding

4、protein，F(xiàn)KBP38)和ADP核糖基化樣因子6的作用蛋白(ADP-ribosylation-likefactor-6interactingprotein1，Aip-1)。已有文獻(xiàn)報(bào)道，NS5A可以通過(guò)不同途徑抑制細(xì)胞凋亡，而FKBP38能通過(guò)其跨膜端將Bcl-2抗凋亡家族的兩個(gè)分子Bcl-2和Bcl-xL錨定到線粒體外膜上從而發(fā)揮抗凋亡作用。由此可以推測(cè)NS5A與FKBP38的相互作用有可能參與抑制細(xì)胞凋亡，值得作進(jìn)一步研究。

5、 為進(jìn)一步驗(yàn)證NS5A與FKBP38的相互作用，首先通過(guò)體外翻譯獲得35S標(biāo)記的NS5A和帶HA標(biāo)簽的FKBP38。免疫共沉淀結(jié)果顯示在HA抗體存在下，NS5A和HA-FKBP38在體外可發(fā)生物理上的結(jié)合。進(jìn)一步構(gòu)建NS5A-myc和HA-FKBP38真核表達(dá)質(zhì)粒并共轉(zhuǎn)Cos7非洲綠猴腎細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無(wú)論是加入myc抗體還是HA抗體，這兩個(gè)蛋白始終在免疫復(fù)合物中被檢測(cè)到。進(jìn)一步在HCV亞基因組復(fù)制子細(xì)胞的裂解液中，加入上述蛋白抗體

6、也獲得同樣結(jié)果。同時(shí)，通過(guò)免疫共沉淀還發(fā)現(xiàn)FK506并不影響上述兩個(gè)蛋白的結(jié)合。然后應(yīng)用免疫熒光和激光共聚焦掃描確認(rèn)兩者在細(xì)胞內(nèi)的相互作用。結(jié)果顯示無(wú)論是瞬時(shí)共轉(zhuǎn)還是在HCV亞基因組復(fù)制子細(xì)胞中，這兩個(gè)蛋白均存在于胞漿的相同位點(diǎn)。進(jìn)一步利用亞細(xì)胞器特異性染料和標(biāo)志蛋白進(jìn)行激光共聚焦發(fā)現(xiàn)FKBP38定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體，而NS5A定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并有部分存在于線粒體。進(jìn)一步運(yùn)用Gal4酵母雙雜合系統(tǒng)和激光共聚焦進(jìn)行突變體分析，發(fā)現(xiàn)NS5A的1

7、48-236位氨基酸參與了和FKBP38的相互作用，且這一片斷包含一個(gè)Bcl-2同源區(qū)；而FKBP38的跨膜區(qū)對(duì)它與NS5A的結(jié)合也至關(guān)重要。上述結(jié)果證明NS5A和FKBP38之間存在直接的相互作用。 為研究NS5A與FKBP38相互作用對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，建立了表達(dá)NS5A的Huh7-NS5A穩(wěn)定細(xì)胞株。利用該細(xì)胞株和HCV亞基因組復(fù)制子細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)這兩種細(xì)胞都能抑制凋亡誘導(dǎo)劑引起的細(xì)胞凋亡；當(dāng)用siRNA干擾技術(shù)抑制HCV亞基因

8、組復(fù)制子細(xì)胞中的NS5A后，復(fù)制子細(xì)胞部分恢復(fù)凋亡敏感性，提示NS5A具有抗凋亡活性。另一方面，利用siRNA干擾技術(shù)抑制內(nèi)源性FKBP38表達(dá)后發(fā)現(xiàn)這兩種細(xì)胞部分恢復(fù)對(duì)凋亡誘導(dǎo)劑的敏感，而對(duì)照細(xì)胞無(wú)明顯差異，提示NS5A的這種抗凋亡活性依賴于FKBP38。在Huh7-NS5A穩(wěn)定細(xì)胞株中通過(guò)siRNA干擾FKBP38后檢測(cè)凋亡誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)凋亡后PARP剪切體的量，發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定細(xì)胞株中被剪切的PARP量明顯較少，說(shuō)明NS5A的抗凋亡作用可能是

9、通過(guò)穩(wěn)定線粒體的方式實(shí)現(xiàn)。鑒于Bcl-2在Huh7細(xì)胞中缺如，以上結(jié)果提示在Huh7細(xì)胞中NS5A可能發(fā)揮類似抗凋亡分子Bcl-2的作用，并且這種作用可能是通過(guò)FKBP38實(shí)現(xiàn)。 綜上所述，本文應(yīng)用Gal4酵母雙雜合系統(tǒng)以HCVNS5A為誘餌對(duì)人胎肝cDNA文庫(kù)進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)FKBP38是NS5A的相互作用蛋白。在確認(rèn)NS5A與FKBP38相互作用的基礎(chǔ)上，研究了這種相互作用對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)了NS5A抑制細(xì)胞凋亡可通過(guò)F