基于酶促等溫指數(shù)擴(kuò)增技術(shù)的生物傳感方法研究.pdf

1、酶促等溫指數(shù)擴(kuò)增技術(shù)（IEXPAR），是一種結(jié)合單鏈剪切和聚合酶延伸的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，這種技術(shù)具有很高的擴(kuò)增效率。其特點(diǎn)在于利用特殊的切刻內(nèi)切酶識別特異的堿基序列并且只剪切雙鏈 DNA中的一條鏈。在聚合酶的作用下，以雙鏈DNA中未被剪切的DNA鏈作為模板從剪切斷端開始發(fā)生聚合反應(yīng)，通過鏈置換的方式置換下被剪切的那條DNA鏈。同時(shí)，新合成的DNA雙鏈在兩種酶作用下又發(fā)生新的剪切和聚合反應(yīng)，從而連續(xù)不斷地生成大量的單鏈DNA。本研究利用此技術(shù)

2、中內(nèi)切酶具有特異性的識別能力和等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)擴(kuò)增出的單鏈易于檢測等優(yōu)點(diǎn)，制備了兩種生物傳感器分別用于核酸和蛋白的檢測。
　　1.基于酶促等溫指數(shù)擴(kuò)增技術(shù)的電化學(xué)生物傳感方法研究
　　本節(jié)描述了一種基于酶促等溫指數(shù)擴(kuò)增技術(shù)的電化學(xué)生物傳感器用于雙鏈基因的檢測。天然條件下生物體中的DNA都是長的雙鏈狀態(tài)，這就導(dǎo)致了其很難被直接檢測。本方法首先用切刻內(nèi)切酶特異性的切割雙鏈目標(biāo)物中的一條鏈，然后斷端在聚合酶的作用下發(fā)生延伸反應(yīng)，隨后以

3、鏈置換的方式得到一條長的單鏈。長單鏈可以催化發(fā)夾自組裝反應(yīng)，生成新的雙鏈DNA，然后引發(fā)新的等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)并生成短單鏈。短單鏈可以與金電極表面發(fā)夾結(jié)構(gòu)的捕獲探針結(jié)合并產(chǎn)生信號的改變。本方法對雙鏈DNA檢測具有良好的分析性能，其檢測范圍為2 fM到500 pM，最低檢測線為1.6 fM。
　　2.基于核酸自組裝結(jié)構(gòu)構(gòu)象變化和酶促等溫指數(shù)擴(kuò)增技術(shù)的熒光生物傳感方法研究
　　本節(jié)描述了一種基于核酸自組裝結(jié)構(gòu)構(gòu)象變化和酶促等溫指數(shù)擴(kuò)增

4、技術(shù)的熒光生物傳感方法用于VEGF的檢測。這種核酸自組裝結(jié)構(gòu)包括一條等溫?cái)U(kuò)增模板鏈，一條適配體鏈，一條引物鏈和一條封閉鏈。在沒有目標(biāo)物存在的情況下，該結(jié)構(gòu)的構(gòu)象穩(wěn)定并且不會發(fā)生等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)。當(dāng)目標(biāo)物存在時(shí)，自組裝結(jié)構(gòu)發(fā)生構(gòu)象變化，致使引物鏈與模板鏈完全雜交，從而觸發(fā)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生的單鏈與分別標(biāo)記有熒光物和淬滅物的雙鏈DNA發(fā)生鏈置換反應(yīng)，產(chǎn)生熒光信號的增加。本方法為VEGF的檢測提供了一種靈敏、特異和簡單的思路。該熒光傳感器