基于核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的克柔念珠菌早期分子診斷技術(shù).pdf

1、念珠菌屬真菌是最常見(jiàn)的機(jī)會(huì)性致病菌，臨床上常見(jiàn)的致病菌主要有白念珠菌（C.albicans）、近平滑念珠菌（C.parapsilosis、熱帶念珠菌（C.tropcalis）、光滑念珠菌(C.glabrata)以及克柔念珠菌(C.krusei)等五種，占人類病原真菌感染的95％。其中白念珠菌引起的感染最為常見(jiàn)，但是近年來(lái)越來(lái)越多的文獻(xiàn)報(bào)道由非白念珠菌引起的感染正逐年增多?？巳崮钪榫鳛榕R床五大常見(jiàn)念珠菌之一，其感染多見(jiàn)于患有血液系統(tǒng)腫瘤

2、等免疫力低下的患者，可引起粘膜感染、真菌血癥以及其它實(shí)質(zhì)器官的感染。臨床上應(yīng)用氟康唑預(yù)防真菌感染、近年來(lái)器官移植的開(kāi)展以及廣譜抗生素等的使用，均使得克柔念珠菌的發(fā)病率逐年上升，引起的死亡率居高不下。
　　目前臨床上常用的病原真菌的診斷方法主要有鏡檢、培養(yǎng)以及病理等形態(tài)學(xué)上的觀察，API20C等生化代謝鑒定方法，血清學(xué)抗原檢測(cè)等免疫學(xué)方法，目前臨床上仍以鏡檢培養(yǎng)以及組織病理結(jié)果作為診斷感染的金標(biāo)準(zhǔn)，但是培養(yǎng)所需要的周期長(zhǎng)、鏡檢和病理

3、學(xué)檢查對(duì)檢驗(yàn)人員要求較高，存在較高的假陽(yáng)性和假陰性。血清學(xué)方法也有待改進(jìn)，容易出現(xiàn)誤診和漏診，延誤患者病情，在臨床應(yīng)用上有一定的局限性。因此臨床上急需一種早期快速、特異的方法來(lái)診斷病原真菌感染。
　　隨著分子生物學(xué)理論和技術(shù)的不斷發(fā)展，目前基于核酸和蛋白質(zhì)的分子診斷技術(shù)已經(jīng)開(kāi)始逐步應(yīng)用于臨床，分子水平的診斷技術(shù)需要的時(shí)間短、特異性和敏感性高，在一定程度上克服了傳統(tǒng)診斷方法的缺陷，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)病原菌的早期、特異診斷，改善患者預(yù)后、提高

4、患者生存率。核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)能在一定溫度下完成對(duì)DNA或RNA的擴(kuò)增，與傳統(tǒng)PCR方法相比，核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)對(duì)儀器的要求極大地簡(jiǎn)化，恒溫水浴即可完成反應(yīng)，時(shí)間也大大地縮短，能滿足實(shí)現(xiàn)操作簡(jiǎn)單、快速診斷的需求。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)針對(duì)基因序列的六個(gè)獨(dú)立片段設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸片段的特異性擴(kuò)增。自從2000年Notomi等報(bào)道這一技術(shù)以來(lái)，目前環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)已經(jīng)被研究用來(lái)結(jié)核桿菌、大腸埃希桿菌、組織胞漿菌、流感病毒、沙門氏菌等多種病原

5、微生物的診斷。
　　Jacobsen MD等利用多位點(diǎn)序列分型(Multilocus sequence typing，MLST)的方法找到克柔念珠菌的6個(gè)管家基因即ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、NMT1、TRP1來(lái)對(duì)克柔念珠菌分型，這些片段都富含單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(Single nucleotidepolymorphism，SNPs)，可以用來(lái)區(qū)分不同的致病菌種，有很強(qiáng)的特異性。本研究根據(jù)這6個(gè)基因片段的大小以及擴(kuò)增子的

6、長(zhǎng)度，選擇ADE2基因位點(diǎn)作為此次實(shí)驗(yàn)的靶基因片段，收集標(biāo)準(zhǔn)菌株和模式菌株共47株菌，其中包括克柔念珠菌（Candidakrusei）13株、克柔念珠菌有性型-東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）也被稱為庫(kù)德里阿茲威（氏）畢赤酵母(Pichia kudriavzevii)2株，以及在進(jìn)化上和克柔念珠菌最近的9種菌株、臨床常見(jiàn)酵母致病菌15株，臨床常見(jiàn)絲狀菌8株作為陰性對(duì)照菌株。提取相關(guān)菌株DNA后，分別采用兩種

7、核酸擴(kuò)增方法即環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術(shù)和實(shí)時(shí)定量熒光PCR(Real-time quantitative，qPCR)，技術(shù)對(duì)所得到的DNA進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè)，并比較兩種方法在診斷的敏感性和特異性上的差異。
　　本研究分別設(shè)計(jì)了針對(duì)克柔念珠菌ADE2基因序列的LAMP技術(shù)和實(shí)時(shí)定量熒光PCR技術(shù)的引物，實(shí)現(xiàn)了對(duì)克柔念珠菌的早期、快速、特異擴(kuò)增。經(jīng)過(guò)敏感性