克柔念珠菌對(duì)口腔上皮細(xì)胞的黏附作用及表達(dá)白細(xì)胞介素-8的影響.pdf

1、背景:口腔念珠菌病是由念珠菌屬感染所引起的口腔黏膜疾病。近年來,隨著廣譜抗生素、細(xì)胞毒性藥物及免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用,艾滋病、糖尿病、惡性腫瘤患者的增多,器官移植術(shù)及導(dǎo)管介入等各種治療手段的開展,宿主的免疫功能低下或發(fā)生菌群失調(diào),使得口腔念珠菌病的發(fā)病率迅速上升。盡管白色念珠菌是主要的條件致病性真菌,但毒力較弱的菌種如克柔念珠菌的感染也在免疫力低下的患者中頻頻發(fā)生。口腔念珠菌病的發(fā)病機(jī)制受到很多因素影響,不僅與念珠菌菌體本身的形態(tài),菌體表

2、面結(jié)構(gòu)及黏附力有關(guān),還與宿主的免疫防御機(jī)制有關(guān)。白色念珠菌黏附于宿主上皮是其在宿主中形成集落及入侵體內(nèi)的第一步,也是念珠菌具有強(qiáng)致病性的標(biāo)志。白細(xì)胞介素-8(IL-8)是中性粒細(xì)胞強(qiáng)有力的趨化因子,在免疫調(diào)節(jié)和炎癥過程中發(fā)揮雙重作用。大量國內(nèi)外研究表明在口腔念珠菌病中,白色念珠菌可以激發(fā)口腔黏膜上皮細(xì)胞產(chǎn)生IL-8等細(xì)胞因子,參與黏膜局部防御反應(yīng)。然而有關(guān)克柔念珠菌對(duì)口腔黏膜上皮細(xì)胞黏附作用的研究并不多見,克柔念珠菌單獨(dú)及與白色念珠菌混

3、合感染后口腔黏膜上皮細(xì)胞表達(dá)IL-8參與口腔黏膜防御反應(yīng)的研究國內(nèi)還未見報(bào)道。
　　 目的:本實(shí)驗(yàn)通過克柔念珠菌與口腔黏膜上皮細(xì)胞的共同培養(yǎng),探討克柔念珠菌對(duì)口腔黏膜上皮細(xì)胞的黏附作用。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和酶聯(lián)免疫反應(yīng)(ELISA)從mRNA和蛋白水平上觀察克柔念珠菌單獨(dú)及與白色念珠菌混合感染對(duì)口腔黏膜上皮細(xì)胞(KB細(xì)胞)表達(dá)IL-8的影響,初步探討IL-8在口腔黏膜上皮細(xì)胞防御克柔念珠菌感染中的可能作用。

4、
　　 方法:1.在體外將克柔念珠菌與KB細(xì)胞共同培養(yǎng),以白色念珠菌與KB細(xì)胞的黏附作為對(duì)照組,黏附后的細(xì)胞爬片經(jīng)革蘭染色,倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)100個(gè)上皮細(xì)胞上黏附的念珠菌數(shù)。胰酶消化后收集細(xì)胞及念珠菌,臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)檢測念珠菌的總數(shù)及菌絲轉(zhuǎn)換率。2.將克柔念珠菌的孢子相和菌絲相菌懸液及與白色念珠菌混合后的孢子相和菌絲相菌懸液分別與KB細(xì)胞共同培養(yǎng),以單獨(dú)培養(yǎng)的KB細(xì)胞作為對(duì)照組,于6、12、24、48小時(shí)提取培養(yǎng)上清液,酶聯(lián)免疫

5、反應(yīng)(ELISA)檢測上清液中IL-8的蛋白含量。3.用Trizol法提取共同培養(yǎng)24小時(shí)后的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測IL-8的mRNA水平。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)間差異進(jìn)行t檢驗(yàn),判斷其統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:1.克柔念珠菌黏附于KB細(xì)胞有時(shí)間依賴性,在24小時(shí)內(nèi)隨著時(shí)間的延長,黏附數(shù)逐漸增多,與對(duì)照組白色念珠菌比較,克柔念珠菌的黏附數(shù)低于白色念珠菌；克柔念珠菌黏附KB細(xì)胞后,其形態(tài)從孢子相向菌絲相的轉(zhuǎn)變也有時(shí)間

6、依賴性,在24小時(shí)內(nèi)隨時(shí)間的延長,菌絲轉(zhuǎn)換率逐漸增高,但克柔念珠菌的總數(shù)卻減少。2.KB細(xì)胞基礎(chǔ)表達(dá)少量的IL-8蛋白,在克柔念珠菌單獨(dú)及與白色念珠菌混合感染KB細(xì)胞后表達(dá)IL-8的蛋白水平均高于對(duì)照組；克柔念珠菌菌絲相單獨(dú)及與白色念珠菌菌絲相混合感染KB細(xì)胞后表達(dá)IL-8的蛋白水平高于孢子相；培養(yǎng)上清液中IL-8的表達(dá)隨時(shí)間的延長而逐漸增加,24小時(shí)達(dá)到高峰,隨后出現(xiàn)下降趨勢(shì)；克柔念珠菌感染KB細(xì)胞后表達(dá)IL-8的蛋白水平,無論是孢子

7、相還是菌絲相,均高于克柔念珠菌和白色念珠菌的混合感染。3.克柔念珠菌單獨(dú)及與白色念珠菌混合感染KB細(xì)胞24小時(shí)后,表達(dá)IL-8mRNA的水平均高于對(duì)照組；克柔念珠菌菌絲相單獨(dú)及與白色念珠菌菌絲相混合感染KB細(xì)胞后表達(dá)IL-8mRNA的水平高于孢子相；克柔念珠菌的孢子相及菌絲相感染KB細(xì)胞后表達(dá)IL-8mRNA的水平均高于克柔念珠菌與白色念珠菌混合的孢子相及菌絲相。
　　 結(jié)論:1.克柔念珠菌對(duì)口腔上皮細(xì)胞的黏附作用有時(shí)間依賴性,