腎小管上皮細(xì)胞白細(xì)胞介素13和白細(xì)胞介素4受體的表達(dá)及其在腎小管損傷中的作用.pdf

1、局灶節(jié)段性腎小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis，F(xiàn)SGS)是常見的腎小球疾病，占我國成人原發(fā)性腎小球腎炎的7.0％，臨床上表現(xiàn)為大量蛋白尿，早期研究表明足細(xì)胞損傷與大量蛋白尿的產(chǎn)生密切相關(guān)，足細(xì)胞受損、脫落構(gòu)成腎小球硬化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。細(xì)胞免疫功能異常在FSGS發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，F(xiàn)SGS患者T細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子可導(dǎo)致足細(xì)胞損傷，其中Th2細(xì)胞因子，如IL-13和IL-4被認(rèn)為可能是主

2、要致病因子，在腎病綜合征復(fù)發(fā)患者，CD4+和CD8+T細(xì)胞的IL-13和IL-4 mRNA表達(dá)升高，同時胞漿IL-13和IL-4蛋白水平表達(dá)也升高。原位雜交技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SGS患者腎組織中IL-13和IL-4 mRNA表達(dá)增加，且腎小管間質(zhì)區(qū)IL-13和IL-4 mRNA表達(dá)量與腎功能變化及24h尿蛋白排泄呈正相關(guān)。有研究表明，足細(xì)胞上表達(dá)IL-13受體和IL-4受體，IL-13和IL-4與相應(yīng)受體結(jié)合，可直接損傷足細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，破壞

3、細(xì)胞間連接蛋白，造成濾過膜通透性的破壞。 FSGS患者足細(xì)胞損傷的同時，常伴隨腎小管上皮細(xì)胞損傷，這點(diǎn)在組織形態(tài)和功能上都有明確的體現(xiàn)，并成為FSGS診斷和鑒別診斷的一個重要特點(diǎn)。既往的觀點(diǎn)認(rèn)為大量蛋白尿致腎小管上皮細(xì)胞損傷、腎小球節(jié)段硬化致出球小動脈狹窄和相應(yīng)腎單位缺血性損傷、腎小球毛細(xì)血管襻和包曼囊壁粘連使尿液反滲入腎間質(zhì)觸發(fā)間質(zhì)炎癥反應(yīng)是FSGS腎小管間質(zhì)損傷的原因，但這些機(jī)制可能造成的組織損傷及其轉(zhuǎn)歸不足以完全解釋臨床

4、上觀察到的現(xiàn)象。部分表現(xiàn)為超大量蛋白尿(＞10g/24h)的FSGS患者，尿蛋白譜分析往往是大分子和小分子蛋白混合存在，這種情況只有在近曲腎小管吸收功能嚴(yán)重受損時才會發(fā)生；一些對治療敏感的患者，在大量蛋白尿緩解的同時，反映腎小管損傷的指標(biāo)也迅速地得到改善，這類患者腎活檢病理常常伴有近端腎小管的急性損傷，于是我們推測，是否可能有一些導(dǎo)致足細(xì)胞病變的因素同時直接攻擊了腎小管上皮細(xì)胞，使其功能和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進(jìn)而觸發(fā)后續(xù)的間質(zhì)病變以及間質(zhì)纖維

5、化。既然乙證實(shí)IL-13和IL-4可通過足細(xì)胞上IL-13受體和IL-4受體導(dǎo)致足細(xì)胞損傷，那么，我們推測，在FSGS患者腎小管上皮細(xì)胞損傷中可能也存在同樣的分子發(fā)病機(jī)制。為探討IL-13和IL-4對近端腎小管上皮細(xì)胞的損傷作用，本研究借助人近端腎小管上皮細(xì)胞系(HK2)，研究人近端腎小管上皮細(xì)胞IL-13受體和IL-4受體的表達(dá)及IL-13和IL-4對腎小管上皮細(xì)胞的影響，并探討其作用機(jī)制。 本研究由兩部分組成： 第一

6、部分：腎小管上皮細(xì)胞IL-13受體和IL-4受體的檢測 目的： 檢測人近端腎小管上皮細(xì)胞IL-13受體和IL-4受體的表達(dá)。 方法： 1．細(xì)胞人近端腎小管上皮細(xì)胞系(HK2)購自ATCC(CRL-2910TM)。 2．用RT-PCR和免疫熒光方法分別從mRNA水平和蛋白質(zhì)水平檢測HK2細(xì)胞上IL-13受體和IL-4受體的表達(dá)。 結(jié)果： 1．RT-PCR結(jié)果顯示正常培養(yǎng)的HK2細(xì)胞有

7、IL-13Ⅰ型受體和IL-4Ⅱ型受體的組成亞鏈-IL-13Rα1和IL-4Rα的mRNA表達(dá)。 2．免疫熒光結(jié)果顯示正常培養(yǎng)的HK2細(xì)胞有IL-13Ⅰ型受體和IL-4Ⅱ型受體的組成亞鏈-IL-13Rα1和IL-4Rα蛋白質(zhì)表達(dá)，呈顆粒狀均勻分布在HK2胞漿中。 結(jié)論： 人近端腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)IL-13Ⅰ型受體和IL-4Ⅱ型受體。 第二部分：IL-13受體和IL-4受體在腎小管損傷中的作用 目的：

8、 通過觀察IL-13和IL-4對近端腎小管上皮細(xì)胞的損傷標(biāo)志物RANTES以及信號傳導(dǎo)通路JAK-STAT6的影響情況，分析IL-13和IL-4對腎小管上皮細(xì)胞的損傷作用，并探討其機(jī)制。 方法： 1．IL-13和IL-4對HK2細(xì)胞的影響作用 用免疫熒光的方法觀察分別用不同濃度(10ng/ml、50ng/ml和100ng/ml)的IL-13和IL-4干預(yù)HK2細(xì)胞12-48小時后HK2損傷標(biāo)志物RANTE

9、S的變化情況。 2．IL-13和IL-4對HK2細(xì)胞的損傷機(jī)制 1)Western blot方法檢測不同時間-濃度的IL-13和IL-4分別干預(yù)HK2細(xì)胞后，JAK-STAT6信號通路的活化情況。 2) Western blot方法檢測JAK-STAT6信號通路特異性抑制劑--來氟米特對IL-13和IL-4作用HK2細(xì)胞的JAK-STAT6信號通路激活的影響。 3)用免疫熒光的方法觀察來氟米特對IL-13

10、和IL-4作用HK2細(xì)胞后RANTES變化的影響。 結(jié)果： 1．IL-13和IL-4呈時間-劑量依賴性影響近端腎小管上皮細(xì)胞RANTES的表達(dá)。50ng/ml IL-13、100ng/ml IL-4作用HK2細(xì)胞48h后的損傷作用最為明顯。正常培養(yǎng)的HK2細(xì)胞RANTES呈陰性，50ng/ml IL-13和100ng/ml IL-4干預(yù)48小時后，陽性細(xì)胞顯著增多。 2．IL-13處理組的JAK-STAT6磷酸化

11、水平在50ng/ml作用10min時開始升高(磷酸化水平為對照組的222.4％±81.9％)，在50ng/ml20min時達(dá)高峰，(磷酸化水平為對照組的307.8％±40.7％)；IL-4處理組的JAK-STAT6磷酸化水平亦在50ng/ml作用10min時開始升高(磷酸化水平為對照組的294.0％±59.7％)，并于100ng/ml20min時達(dá)高峰，(磷酸化水平為對照組的1618.0％±229.9％)。 3．來氟米特干預(yù)＋I(xiàn)

12、L-13處理組和來氟米特預(yù)干預(yù)+IL-4處理組與陰性對照相比，JAK-STAT6磷酸化水平均無明顯變化，磷酸化水平與陰性對照組相比分別為：43.6％±0.4％vs41.2％±2.4％，P＞0.05，20.6％±0.8％vs14.9％±6.7％，P＞0.05，無統(tǒng)計學(xué)差異；而較陽性對照STAT6磷酸化水平明顯降低，相比分別為：43.6％±0.4％vs89.3％±8.3％，P＜0.01，20.6％±1.4％vs44.8％±7.5％，P＜0.