山羊白細(xì)胞介素-4和白細(xì)胞介素-18基因的克隆、表達(dá)及生物學(xué)活性分析.pdf

1、細(xì)胞因子是在抗原遞呈細(xì)胞（APCs）、淋巴細(xì)胞和其它宿主細(xì)胞間發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的一類高活性多功能的蛋白質(zhì)多肽分子。白細(xì)胞介素4（IL-4）和白細(xì)胞介素-18（IL-18）在介導(dǎo)體液免疫反應(yīng)、細(xì)胞免疫反應(yīng)、抵抗微生物感染和抗腫瘤方面均起著非常重要的作用。
　　 根據(jù)GenBank中發(fā)表的山羊IL-4和IL-18基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物，應(yīng)用RT-PCR方法擴(kuò)增出了山羊IL-4和IL-18的全序列（pGIL-4，pGIL-18），將二者

2、克隆到pMD18-T載體中，經(jīng)酶切分析、序列測(cè)定鑒定及序列分析，克隆得到的pGIL-4基因的開放閱讀框含有408個(gè)核甘酸，編碼135個(gè)氨基酸，包含24個(gè)氨基酸的信號(hào)肽。PGIL-18全基因有582個(gè)堿基，編碼193個(gè)氨基酸，前36個(gè)氨基酸殘基為前導(dǎo)肽。通過CLUSTALX和MEGA4.0軟件繪制了多種哺乳動(dòng)物IL-4和IL-18的氨基酸進(jìn)化樹。
　　 自pMD-pGIL-4和pMD-pGIL-18中分別擴(kuò)增其成熟蛋白（mIL-4

3、和mGIL-18）基因，并將其亞克隆至原核表達(dá)載體pET-32a（+）和pET-28a（+）中，構(gòu)建了pET-32a（+）-mGIL-4和pET-28a（+）-mGIL-18原核表達(dá)載體，然后分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)BL21中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析，結(jié)果表明所得到重組蛋白分別約為31.3KDa和22.3KDa。將這兩個(gè)重組蛋白經(jīng)超聲波裂解，主要包涵體形式表達(dá)。
　　 利用MTT法檢測(cè)山羊重組白介素-4（rm

4、GIL-4）對(duì)山羊外周血T淋巴母細(xì)胞的增殖活性，發(fā)現(xiàn)rmGIL-4能顯著刺激山羊外周血T淋巴母細(xì)胞的增殖，并在一定劑量范圍內(nèi)，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，在8μg/ml時(shí)對(duì)T淋巴母細(xì)胞的刺激效應(yīng)最強(qiáng)。為了檢測(cè)山羊重組白介素-18（rmGIL-18）在體外促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞和分泌NO的效應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了小鼠腹腔巨噬細(xì)胞對(duì)中性紅的吞噬能力，并測(cè)定了rmGIL-18作用于巨噬細(xì)胞后細(xì)胞培養(yǎng)液中NO的濃度，結(jié)果顯示rmGIL-18對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的