環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)果汁中耐熱菌的研究.pdf

1、分類號(hào)：IS2QZ：壘密級(jí)：公玨單位代碼：!QQ墨魚學(xué)號(hào)：2QQ墨l蘭量環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)果汁中耐熱菌的研究Study011loopmediatedisothermalAmplification(LAMP)fortheRapidDetectionofAlicyclobacillusacidoterrestrisinJuice學(xué)位申請(qǐng)人：陳靜指導(dǎo)教師：袁耀武教授張偉教授學(xué)科專業(yè)：微生物學(xué)學(xué)位類別：理學(xué)碩士授予單位：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)答辯

2、日期：0年五月二十九日摘要酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌(彳acidoterrestris)，簡稱耐熱菌(ATB)，是重要的食品工業(yè)腐敗菌。其顯著特點(diǎn)是可以在溫度20“70℃和pH20～60的高溫低酸環(huán)境下生長。因此巴氏滅菌不能除去此菌。在濃縮果汁中該菌不繁殖代謝，但一旦稀釋成低濃度的飲用果汁時(shí)，在常溫下即代謝產(chǎn)生愈創(chuàng)木酚、鹵酚，使果汁口感風(fēng)味變差、濁度升高、形成沉淀導(dǎo)致產(chǎn)品品質(zhì)下降。歐美各國要求每lOg蘋果濃縮汁中耐熱菌的含量小于1個(gè)，耐熱菌逐漸

3、成為我國蘋果汁行業(yè)產(chǎn)品出口所遭遇的主要技術(shù)壁壘。我國對(duì)耐熱菌的研究屬于起步階段，主要集中在分離方法和控制上。果汁中耐熱菌快速檢測(cè)方面的研究比較缺乏。傳統(tǒng)的檢測(cè)耐熱菌的方法操作繁瑣、檢測(cè)時(shí)間較長，通常需要4“7d才能完成，并且靈敏度較低。因此需要建立一種快速、靈敏的檢測(cè)果汁中耐熱菌的方法。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(100pmediatedisothermalamplification，簡稱LAMP)是2000年Notomi等開發(fā)出的一種新的核酸擴(kuò)增

4、技術(shù)。該技術(shù)以其靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速、操作簡便、檢測(cè)成本低等優(yōu)點(diǎn)在病毒、真菌、細(xì)菌以及轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)中得到應(yīng)用。因此，建立LAMP技術(shù)檢測(cè)耐熱菌對(duì)于控制耐熱菌引起果汁變質(zhì)具有重要意義。本文確定了耐熱菌的培養(yǎng)方法、菌體計(jì)數(shù)方法，研究了DNA提取方法，并制備了DNA提取液，作為LAMP檢測(cè)的模板。選擇NCBI公布的耐熱菌的保守序列AB042057，使用在線軟件(https：／／primerexplorerjp／lamp300／inde

5、xhtml)設(shè)計(jì)LAMP反應(yīng)的6條引物。對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了LAMP的反應(yīng)體系為：內(nèi)引物(FIP和B口)各18mmol／L，外引物(F3和B3)各03mmol／L，環(huán)引物(LB)09mmol／L，Mg十濃度為3mmol／L，dNTPs濃度5mmol／L，8U的BstDNA聚合酶大片段，2此DNA模板。LAMP的反應(yīng)過程為：先在63℃水浴鍋中反應(yīng)20min，然后在80℃水浴鍋中水浴10min終止反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，通過肉眼觀察有無白色

6、焦磷酸鎂沉淀即可判斷LAMP反應(yīng)是否發(fā)生，亦可通過瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)反應(yīng)是否發(fā)生。利用LAMP方法對(duì)8株耐熱菌菌株，6株脂環(huán)酸芽孢桿菌屬的非耐熱菌菌株和13株其它芽孢桿菌進(jìn)行特異性試驗(yàn)。結(jié)果表明，8株耐熱菌為陽性，其他19株菌株為陰性。為了評(píng)估LAMP檢測(cè)耐熱菌靈敏度和人工污染檢出限，進(jìn)行了PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)的引物是LAMP的兩條外引物(F3和B3)。結(jié)果表明，LAMP檢測(cè)耐熱菌的靈敏度為225CFU／mL，人工污染耐熱菌的果汁的檢

7、出限為225CFU／mL。采用試劑盒提取DNA，2h內(nèi)即可完成反應(yīng)。對(duì)照PCR耗時(shí)3h，檢測(cè)耐熱菌的靈敏度為225CFU／mL，人工污染耐熱菌的果汁的檢出限為2250CFU／mL。LAMP的靈敏度和檢出限是PCR方法的100倍。比較了6種模板制備方法對(duì)LAMP檢測(cè)果汁中耐熱菌的影響。研究表明LAMP方法對(duì)制各模板DNA的要求不高。采用熱裂解法提取DNA，不僅節(jié)約提取時(shí)間，而且也將大大降低檢測(cè)成本。研究表明LAMP方法將成為可以替代PCR