莖環(huán)型引物-環(huán)介導等溫擴增技術(shù)檢測奶粉中單增李斯特菌的研究.pdf

1、單核細胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes,LM)簡稱單增李斯特菌,是一種能夠引起人畜共患病的食源性致病菌,屬李斯特菌屬。廣泛分布于自然界,食用了被單增李斯特污染的食物,可導致人和動物敗血癥、流產(chǎn)、腦膜炎等,病死率高達30％～70%,是人類最重要的食源性病原菌之一。單增李斯特菌的檢測、鑒定以及防控技術(shù)已經(jīng)受到極大的關(guān)注,其檢測方法一直沿用過去傳統(tǒng)的分離鑒定方法,己不能適應現(xiàn)代快速檢測的要求。
　　 環(huán)介導

2、等溫擴增技術(shù)(Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是一種新穎的核酸體外擴增技術(shù),具有簡單、快速、敏感、特異性強的特點,已經(jīng)應用于檢測病原菌等諸多領(lǐng)域。該方法自身最大的局限性就是易出現(xiàn)假陽性。施本研究利用LAMP技術(shù)檢測單增李斯特菌,對LAMP引物進行設(shè)計、篩選及改進,選擇帶有一定莖環(huán)結(jié)構(gòu)的引物,避免由于多條引物在同一條件下擴增,可能互補擴增而出現(xiàn)的假陽性,進一步提高LAMP檢測的準確性,可

3、稱之為莖環(huán)型引物-LAMP(Stcnnloop-PrimerLoop-mediatedIsothermalAmplification,簡稱SLP-LAMP)。
　　 本試驗以單增李斯特菌hlyA基因為靶基因,應用在線引物設(shè)計軟件(https://primerexplorer.tp/lamp4.0.0/index.html)設(shè)計篩選出一套具有一定莖環(huán)結(jié)構(gòu)的LAMP引物,建立了莖環(huán)型引物-環(huán)介導等溫擴增技術(shù)檢測單增李斯特菌的方法。對

4、反應時間、反應溫度、Mg2+濃度等擴增條件進行優(yōu)化,確定25μL的SLP-LAMP反應體系為:內(nèi)引物FIP和BIP各1.0μmol/L,外引物F3和B3各0.2μmol/L,dNTPs0.4mmol/L,MgCl24mmol/L,,10×BstDNA聚合酶反應緩沖液2.5μL,8U/μL的BstDNA聚合酶0.6μL,DNA模板1.5μL,滅菌的去離子水補足體系。SLP-LAMP反應過程是首先在63℃水浴鍋中反應50min,然后將其放入

5、80℃水浴鍋中,水浴5min終止反應,通過肉眼觀察有無白色焦磷酸鎂沉淀,即可判斷是否發(fā)生了SLP-LAMP反應,亦可通過瓊脂糖凝膠電泳證實反應是否發(fā)生。通過限制性內(nèi)切酶ClaⅠ酶切擴增產(chǎn)物,測得酶切片段與理論預期值相符,驗證了方法的正確性。
　　 本研究對3株單增李斯特菌、5株李斯特屬的非單增李斯特菌株和14株其他食源性致病菌進行特異性試驗。結(jié)果表明,3株單增李斯特菌結(jié)果為陽性,其他19株菌株為陰性。研究了6種從人工污染單增李斯

6、特菌的奶粉中提取模板DNA的方法,結(jié)果表明SLP-LAMP檢測對制備模板DNA方法的要求不高。
　　 本研究對SLP-LAMP法快速檢測單增李斯特菌進行了研究,確定了檢測純培養(yǎng)物的靈敏度,人工污染檢出限,并與普通PCR檢測方法進行了對比。結(jié)果表明:SLP-LAMP檢測單增李斯特菌的靈敏度為2.45×10-1CFUJ/mL,其對人工污染奶粉樣品的檢出限為7.32×10-1CFU/mL。采用試劑盒提取DNA,從樣品處理到報告結(jié)果,耗

7、時2h。而對照,PCR檢測單增李斯特菌純培養(yǎng)物的靈敏度為2.45×103CFU/mL,人工污染單增李斯特菌的檢出限為7.32×103CFU/mL。采用同樣方法提取DNA,從樣品處理到報告結(jié)果,耗時4h。
　　 研究表明,本研究建立的SLP-L,AMP法檢測食品中單增李斯特菌的方法具有特異性強、靈敏度高,方便快捷、成本低等特點,并且通過大量的試驗證明,篩選設(shè)計帶有莖環(huán)型引物對避免反應過程中出現(xiàn)假陽性起到了一定的作用。為LAMP的檢