環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)快速檢測蠟樣芽孢桿菌研究.pdf

1、蠟樣芽孢桿菌是引起食物中毒的常見致病菌之一，食物暴露2h以上極易受污染，引起食物中毒的食品多為乳制品，米飯等蛋白質(zhì)含量多的食品。目前，國內(nèi)檢測食品中蠟樣芽孢桿菌仍采用傳統(tǒng)的方法，其操作繁瑣，檢測時間長，通常需要3～5d。本研究建立了一套用LAMP技術(shù)快速檢測蠟樣芽孢桿菌的方法，縮短了檢測時間，提高檢測方法的靈敏性。 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(LAMP)是日本的NOTOMI發(fā)明的一種新的核酸擴增技術(shù)，因為其操作簡單、快速、特異性高、成本

2、低等優(yōu)點，成為可以替代PCR的新的核酸擴增技術(shù)。蠟樣芽孢桿菌在環(huán)境中廣泛存在，極易污染食品及食品原料，并且耐高溫不易被殺死，可以產(chǎn)生導(dǎo)致嘔吐和腹瀉兩種類型的食物中毒。因此，建立LAMP快速檢測蠟樣芽孢桿菌的方法對于控制蠟樣芽孢桿菌的食物中毒具有重要意義。 本研究針對蠟樣芽孢桿菌的特異基因hblA設(shè)計引物，用LAMP引物在線設(shè)計引物軟件設(shè)計引物，對內(nèi)引物濃度、外引物濃度、Mg2+濃度、甜菜堿濃度、BST酶濃度等反應(yīng)條件進行了優(yōu)化，

3、建立LAMP反應(yīng)體系。 LAMP反應(yīng)體系如下:F3與B3(LAMP反應(yīng)外引物)各5pmol/μL；BIP與FIP(LAMP反應(yīng)內(nèi)引物)40pmol/μL；其它反應(yīng)組分終濃度分別為:1.0mmol/L dNTP，1.0mmol/L Betaine，6.0mmol/L MgSO4，2.5μL Bst酶緩沖液(20mM Tris-HCl(pH8.8，25℃)，10mM KCI，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％.

4、Triton X-100)，lμL(8U Bst大分子聚合酶，lμL目標(biāo)DNA，純水補足體積到25μL。擴增反應(yīng)條件為62℃保存1h，80℃ 2min使酶滅活。 FTA卡是用螫合劑和變性劑浸泡過的纖維基質(zhì)，他可以在接觸微生物時將其吸附并裂解細胞，使DNA吸附在纖維基質(zhì)上。FTA可以高效、快速、低損耗的提取DNA。本研究將FTA與LAMP方法相結(jié)合，檢測蠟樣芽孢桿菌。 對LAMP快速檢測蠟樣芽孢桿菌的方法進行了評價，測定了

5、其檢出限，特異性，敏感性，符合率，并與PCR檢測方法進行了對比。嘗試了在反應(yīng)產(chǎn)物中加入EB，在紫外燈下快速觀測反應(yīng)結(jié)果的試驗。結(jié)果表明:LAMP對抽提的DNA最低檢出濃度為4.4cfu/mL，PCR對DNA最低檢出濃度44cfu/mL。LAMP對消毒乳中蠟樣芽孢桿菌的活菌濃度最低檢出量為5.7cfu/mL，而PCR的檢出限為57cfu/mL。LAMP技術(shù)的靈敏度是PCR的10倍，并且比PCR方便快捷。LAMP擴增最短可在20min內(nèi)完成