基于顏色判定的環(huán)介導等溫擴增技術快速檢測銅綠假單胞菌及其OprD2耐藥基因的研究.pdf

1、目的
　　銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa,PAE)為條件致病菌,分布廣泛,在正常情況下不致病。但當人體免疫力降低時(如:長期應用激素、腫瘤化療、AIDS)或嚴重創(chuàng)傷(如大面積燒傷、大型手術)或醫(yī)療操作(如氣管切開、插管)后,PAE引起的感染性疾病不斷增加。隨著抗生素的廣泛使用,耐藥銅綠假單胞菌的發(fā)生率增多,特別是多重耐藥菌,使臨床上治療該病原菌引起的相關感染變得越來越來困難。然而傳統(tǒng)的細菌學檢查方法時間長

2、、敏感性低,一直不能滿足臨床診治的需求。因此建立了一種新的、簡單、快速的現場檢測方法,對銅綠假單胞菌及耐藥性的早期診斷和治療具有重大意義。
　　本研究目的:了解臨床標本中分離的銅綠假單胞菌對16種抗菌藥物的耐藥情況,為臨床合理使用抗生素提供參考。對多重耐藥銅綠假單胞菌進行相關耐藥基因的研究。建立一種基于顏色判定的,能夠快速準確地檢測銅綠假單胞菌及其OprD2耐藥基因的LAMP方法。
　　方法
　　對臨床收集47株耐藥銅

3、綠假單胞菌采用K-B紙片擴散法測定對慶大霉素等16種抗菌藥物的敏感性。PCR擴增檢測收集的銅綠假單胞菌標本中的耐亞胺培南類IMP、VIM、GES、GIM、OXA-10、OprD2耐藥基因。針對銅綠假單胞菌OprL、OprD2基因設計LAMP引物,通過引物特異性識別OprL、OprD2的6個獨立區(qū)域來快速檢測銅綠假單胞菌特有OprL基因和OprD2耐藥基因。如果在反應前添加熒光染料羥基萘酚藍(HNB)或鈣黃綠素(Calcein),其結果可

4、以通過肉眼觀察反應前后顏色變化來判定并經瓊脂糖凝膠電泳驗證。對該技術進行特異性、靈敏度分析,用LAMP擴增法、PCR擴增法和臨床傳統(tǒng)方法同時檢測臨床標本。
　　結果
　　1.47株耐藥PAE對頭孢噻肟耐藥率最高占97.87％,左旋氧氟沙星耐藥率占40.42%,氨曲南耐藥率占38.30%,哌拉西林耐藥率34.04%,美羅培南耐藥率占29.79%,亞胺培南、環(huán)丙沙星、頭孢哌酮的耐藥率占27.66%。
　　2.47株PAE中

5、VIM基因陽性12株,陽性率25.53%,OXA-10基因陽性2株,陽性率4.26%,OprD2基因缺失23株,缺失率占48.94%,而IMP、GIM、GES基因均陰性。OprD2基因缺失株的頭孢噻肟、左氧氟沙星、氨曲南、哌拉西林、亞胺培南和美羅培南耐藥率分別為100%(23/23)、56.52%(13/23)、47.83%(11/23)、47.83%(11/23)、47.83%(11/23)和43.48%(10/23)。統(tǒng)計學分析結果

6、顯示:與OprD2基因陽性株相比,OprD2基因缺失株的亞胺培南、左旋氧氟沙星、美洛培南耐藥比例明顯升高(卡方值為9.155、4.846、4.037,P值為0.002、0.028、0.045,差異有統(tǒng)計學意義)。
　　3.設計出針對銅綠假單胞菌OprL基因、OprD2耐藥基因可直接肉眼判讀結果的等溫擴增檢測方法。本等溫擴增檢測法只擴增銅綠假單胞菌,對其他菌不擴增,顯示出良好的特異性。其最低檢測限為17.414pg/μl,PCR方法

7、最低檢出限為174.414pg/μl,LAMP方法檢測靈敏度是PCR方法檢測靈敏度的10倍,靈敏度高。LAMP法與PCR法對臨床銅綠假單胞菌OprL基因和OprD2耐藥基因檢出率相當。
　　結論
　　1.臨床銅綠假單胞菌耐藥情況嚴重,耐藥銅綠假單胞菌OprD2基因缺失較為普遍,47株中缺失23株占(48.94%)。OprD2基因缺失導致銅綠假單胞菌以亞胺培南為主的耐藥,因此明確OprD2基因分布狀況有助于臨床抗菌藥物的選用。