基于等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的電化學(xué)生物傳感器對(duì)核酸檢測(cè)的新策略研究.pdf

1、核酸的超靈敏檢測(cè)在病原菌分析，分子診斷，腫瘤早期篩查，環(huán)境監(jiān)測(cè)及法醫(yī)鑒定等領(lǐng)域起著十分重要的作用，因而受到廣泛的關(guān)注。在核酸超靈敏檢測(cè)的多種分析方法中，恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)由于無(wú)需改變溫度越來(lái)越多的發(fā)展起來(lái)。電化學(xué)生物傳感器由于其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)如操作簡(jiǎn)便，響應(yīng)快，成本低，及易于小型化等被廣泛應(yīng)用于生物分子的檢測(cè)。本研究以電化學(xué)生物傳感器為檢測(cè)平臺(tái)，整合多種恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，對(duì)核酸進(jìn)行快速高靈敏檢測(cè)。研究?jī)?nèi)容分為以下兩部分:
　　1.基于等溫指數(shù)擴(kuò)

2、增反應(yīng)的電化學(xué)生物傳感器對(duì)miRNA快速靈敏檢測(cè)
　　MiRNA是一類內(nèi)源性非編碼的小分子RNA，其異常表達(dá)與相關(guān)腫瘤的早期診斷，臨床用藥及預(yù)后判斷等密切相關(guān)。因此發(fā)展簡(jiǎn)便、快速、超靈敏的miRNA檢測(cè)新方法具有十分重要的意義。本研究整合靶物質(zhì)輔助的等溫指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)(EXPAR)及酶催化信號(hào)放大策略，以電化學(xué)生物傳感器為平臺(tái)，建立一種miRNA檢測(cè)新技術(shù)。靶miRNA與電極表面已修飾的模板DNA結(jié)合，作為引物觸發(fā)延伸反應(yīng)形成雙鏈。

3、雙鏈中的其中一條鏈被限制性內(nèi)切酶識(shí)別其特異位點(diǎn)并進(jìn)行切割，釋放，繼續(xù)進(jìn)行延伸反應(yīng)。釋放出的DNA片段與靶miRNA有著相同的序列（T代替U），可與其余模板結(jié)合進(jìn)行延伸，形成靶物質(zhì)輔助的等溫指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)。電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)隨著靶miRNA濃度增加而減小。所建立的方法最低檢測(cè)限為98.9fM，其線性范圍為100fM到10nM。用電化學(xué)循環(huán)伏安法及阻抗譜來(lái)表征電極表面修飾過(guò)程。該傳感器能夠區(qū)分miRNA家族中單堿基錯(cuò)配的成員。該方法有望用于實(shí)際樣

4、本中miRNA檢測(cè)，并在生物醫(yī)學(xué)研究及臨床診斷領(lǐng)域具有很大的應(yīng)用潛力。
　　2.基于均相靶識(shí)別誘導(dǎo)原位轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增的電化學(xué)傳感技術(shù)超靈敏檢測(cè)核酸
　　以電化學(xué)傳感器為平臺(tái)，整合均相核酸轉(zhuǎn)錄、核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)及酶催化放大技術(shù)，建立一種基于均相靶識(shí)別誘導(dǎo)原位轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增技術(shù)的實(shí)用、準(zhǔn)確、超靈敏的核酸檢測(cè)方法。在均相環(huán)境中，靶DNA與莖環(huán)探針結(jié)合使其打開(kāi)，在引物、KF聚合酶、dNTPs存在的條件下進(jìn)行循環(huán)鏈置換反應(yīng)，延伸的DNA雙鏈含有T