基于DNA鏈置換反應(yīng)構(gòu)建的電化學(xué)生物傳感器在核酸檢測中的應(yīng)用.pdf

1、納米技術(shù)是在小于100納米的尺度下對材料和物體進(jìn)行研究的技術(shù)。八十年代初期，納德里安·西曼(Nadrian Seeman)首先提出了 DNA納米技術(shù)的概念。其關(guān)鍵是核酸鏈，通過堿基配對的高特異和可預(yù)測性實(shí)現(xiàn)設(shè)計的可控操作。DNA納米技術(shù)分為兩個領(lǐng)域：結(jié)構(gòu) DNA納米技術(shù)(Structural DNA nanotechnology)和動態(tài) DNA納米技術(shù)(Dynamic DNA nanotechnology)。其中后者運(yùn)用一種 toeho

2、ld介導(dǎo)的鏈置換反應(yīng)(Toehold-mediated strand displacement)機(jī)制使雙鏈和單鏈之間進(jìn)行動態(tài)重組，形成更穩(wěn)定的新雙鏈并且釋放出一條單鏈。Toehold是一個短的單鏈區(qū)域，作為鏈置換反應(yīng)的動力，其通常由5-8個堿基組成。利用鏈置換原理設(shè)計了一系列包括邏輯電路、納米機(jī)器人、鏈置換級聯(lián)反應(yīng)放大器等納米設(shè)備，其強(qiáng)大的置換動力和可預(yù)測性使得動態(tài) DNA納米技術(shù)有望用于分子電子學(xué)以及醫(yī)療等領(lǐng)域。
　　在 DNA

3、生物傳感器中，DNA被當(dāng)作生物識別元件去識別靶標(biāo)。在識別過程中，產(chǎn)生的微小變化可以通過信號轉(zhuǎn)換元件轉(zhuǎn)換成可測定的信號以及肉眼可觀察到的圖形，從而實(shí)現(xiàn)對待測靶標(biāo)的痕量分析。常見的信號轉(zhuǎn)換元件，如電化學(xué)、熒光，石英晶體微天平和場效應(yīng)晶體管等，使 DNA生物傳感器得以繁榮發(fā)展。其中，電化學(xué) DNA生物傳感器因成本低廉、易微型化、靈敏度高、抗干擾能力強(qiáng)等優(yōu)勢，在床旁檢測、分子診斷等領(lǐng)域有極大的應(yīng)用前景。
　　本工作中，將動態(tài) DNA納米技

4、術(shù)與電化學(xué)生物傳感器結(jié)合起來，圍繞著如何提高信噪比、實(shí)現(xiàn)傳感器的快速制備及靶標(biāo)的一步檢出等關(guān)鍵問題設(shè)計一系列基于 DNA結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換的檢測平臺。兩種基于鏈置換反應(yīng)的電化學(xué)生物傳感器，一類是“信號關(guān)”(“Signal off”)模式，檢測靶標(biāo)前后信號變化由高到低，另一類是“信號開”(“Signal on”)模式，即靶標(biāo)檢測前后信號變化由低到高。本文開展的工作是關(guān)于基因檢測方法學(xué)的研究，具體內(nèi)容如下：
　　第一章：基于 toehold設(shè)計

5、的半雜交雙鏈探針構(gòu)建“Signal off”電化學(xué)核酸傳感器
　　在“Signal off”模式中，結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換類電化學(xué) DNA傳感器的靈敏度不高主要是因?yàn)殡姌O表面的氧化還原標(biāo)志物無法清除，遮掩了靶標(biāo)產(chǎn)生的信號。為了解決這個問題，設(shè)計了一種半雜交的雙鏈探針，由一條較長的巰基鏈和一條較短的信號鏈組成，類似一個帶有切口的莖環(huán)。半雜交體可以提供驅(qū)動 DNA鏈置換反應(yīng)的 toehold。當(dāng)檢測靶標(biāo)時，靶標(biāo)與巰基鏈雜交形成新的完全互補(bǔ)的雙鏈體，

6、同時信號鏈被置換下來脫離電極表面。這個反應(yīng)可以從根本上消除電極表面上的信號鏈在靶標(biāo)響應(yīng)后殘留的背景電流，從而提高檢測的靈敏度。這個新型的基于 toehold的電化學(xué) DNA傳感器實(shí)現(xiàn)了低至0.2 pM/L的檢測限，比經(jīng)典莖環(huán)探針構(gòu)建的電化學(xué)檢測平臺的檢測限低兩個數(shù)量級。同時，雙鏈探針中的 toehold賦予鏈置換反應(yīng)高的選擇性以及與靶標(biāo)結(jié)合的動力。此外，該傳感器還能再生，重復(fù)使用，甚至還能在復(fù)雜的人血清中檢測低濃度的靶標(biāo)，體現(xiàn)出良好的抗

7、干擾能力。綜上所述，基于 DNA鏈置換反應(yīng)構(gòu)建的電化學(xué)傳感平臺具有高靈敏、高選擇性等優(yōu)點(diǎn)，顯示了其比傳統(tǒng)電化學(xué)DNA傳感器在床旁檢測中更具有應(yīng)用前景。
　　第二章：基于 DNA鏈置換反應(yīng)和酶催化放大技術(shù)構(gòu)建的一步式高靈敏DNA電化學(xué)傳感器
　　“Signal off”模式的電化學(xué)傳感器檢測靶標(biāo)時，其信號變化率不超過100％，因此設(shè)計了另一種“Signal on”模式的電化學(xué)傳感器。首先，依舊是先將一條雙鏈探針固定在電極表面，

8、與前面不同的是，探針中巰基鏈的另一端是電活性分子，而另一條鏈?zhǔn)菦]有任何修飾的輔助鏈，只是為了提供一個toehold。當(dāng)靶標(biāo)存在時，該輔助鏈通過toehold與靶標(biāo)雜交形成新的雙鏈體脫離電極表面被釋放到溶液中。另外，前一個設(shè)計還有一個不足之處是受1:1的響應(yīng)限制，即每個靶標(biāo)分子只能與一個捕獲鏈雜交導(dǎo)致一個鏈置換事件的發(fā)生，這樣就限制了其在實(shí)際應(yīng)用中的檢測范圍。因此這里還引入了核酸外切酶Ⅲ催化的信號放大策略。由于新雙鏈體的一端是平末端，因此

9、會被溶液中的核酸外切酶識別并且特異的從3'平末端開始切割，直到輔助鏈被完全水解，靶標(biāo)被釋放參與下一個鏈置換反應(yīng)。反應(yīng)60分鐘后，最終電極表面固定的大部分巰基鏈在鹽離子的作用下回到其最原始的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，同時電活性分子被拉到電極表面進(jìn)行快速的電子傳遞，產(chǎn)生一個很強(qiáng)的電學(xué)信號。信號的大小是依據(jù)亞甲基藍(lán)距離電極表面的遠(yuǎn)近來判斷的，實(shí)驗(yàn)證明距離越遠(yuǎn)信號越小，反之，則信號越大。這個1:N的靶循環(huán)策略達(dá)到了42 fM/L的檢測限，比前一個無酶鏈置換電化