基于解旋酶酶促信號擴增的氧化石墨烯生物傳感平臺檢測microRNA的研究.pdf

1、目前，分子診斷生物學研究正不斷地對人類疾病診斷產(chǎn)生變革性的影響，它可以幫助醫(yī)生更好地了解每個病人的臨床狀況，如當前疾病狀態(tài)、預測疾病狀態(tài)、藥物反應和治療預后。分子診斷的本質(zhì)在于靈敏檢測疾病生物標志物，如蛋白質(zhì)、碳水化合物或核酸。MicroRNAs(miRs)作為一組內(nèi)源性非編碼RNA（18-25核苷酸），在多種疾病細胞過程中發(fā)揮著重要的作用。值得注意的是，miRs的頻繁異常表達將這些小細胞分子成分加入到癌癥的潛在生物標志物行列。因此，敏

2、感和有效的檢測方法對于更好地理解這些相對較小的核酸分子和進一步驗證其在臨床分子診斷中的功能具有重要的意義。然而，由于它們具有小尺寸和高度同源等特性，敏感和經(jīng)濟的miRs檢測方法仍然具有很大的挑戰(zhàn)性。
　　近年來，各種以檢測靈敏度和特異性為研究重點的新方法處于不斷開發(fā)中，如納米顆粒復合探針、等溫擴增方法和電化學方法等。其中，大部分等溫擴增方法所依靠的鏈置換、鏈雜交和鏈延伸等循環(huán)擴增原理都與核酸酶密切相關，如聚合酶、核酸內(nèi)切酶或切口酶

3、、雙鏈特異性核酸酶等。解旋酶是一類重要的核酸酶，它可以利用ATP水解的能量沿著核酸磷酸骨架定向移動，分離兩條退火的核酸鏈（即DNA鏈、RNA鏈或RNA-DNA雜交鏈）。解旋酶對核酸分子探針內(nèi)氫鍵的水解活性，使其在相應的分子診斷系統(tǒng)中具有巨大的潛在應用性，特別是以雜交反應為檢測原理的傳感系統(tǒng)。
　　本文通過pET24a-RecQE重組質(zhì)粒誘導表達獲得大腸桿菌RecQ解旋酶（RecQE），系統(tǒng)研究了RecQE在不同miR氧化石墨烯（G

4、O）傳感平臺中的作用機理以及酶學活性。分析了RecQE在以1:1雜交反應以及雜交鏈反應（HCR）為檢測原理的傳感平臺中的分子作用機制，構建了RecQE輔助GO傳感平臺和高靈敏RecQE酶促HCR/GO傳感平臺，并對這兩個傳感平臺做了進一步的研究，主要內(nèi)容如下：
　　(1)開發(fā)了一種以1:1雜交反應為檢測原理的RecQE酶輔助GO傳感平臺，用于系統(tǒng)的研究解旋酶對傳感平臺中雜交反應的分子作用機制。此傳感平臺通過簡單的DNA/RNA雜交

5、反應，實現(xiàn)DNA探針（FDNA）所標記熒光基團在 GO表面的熒光猝滅與恢復，通過熒光信號的變化直觀地分析RecQE對雜交反應的分子作用機制。RecQE參與的檢測系統(tǒng)熒光信號強度增強高達22.56％，這表明RecQE對GO表面的雜交反應具有明顯的促進作用。RecQE酶輔GO傳感平臺檢測let-7a的靈敏度實驗與特異性實驗的結(jié)果表明，此傳感平臺能夠高特異性的區(qū)分各種堿基錯配的miRs并能準確檢測系統(tǒng)相對應的靶目標，能夠靈敏的定量檢測miR至

6、0.18 nM。這說明，此 GO傳感平臺并沒有因 RecQE的引入而影響其檢測靈敏度以及特異性，驗證了RecQE對此GO傳感平臺的優(yōu)良兼容性。此外，F(xiàn)DNA與阻斷DNA (BDNA)組成的FDNA-BDNA復合探針可以有效阻止RecQE以及其他小分子蛋白與FDNA的非特異性結(jié)合，降低外界干擾所引起的系統(tǒng)背景熒光強度變化。
　　(2)利用RecQE在FDNA-BDNA-GO傳感平臺當中的作用機理，進一步開發(fā)了一種基于Rec

7、QE酶促雜交鏈反應（HCR）信號擴增的靈敏檢測 miR的 GO傳感平臺。相比于無酶 HCR/GO傳感平臺，RecQE酶促HCR/GO傳感平臺熒光信號強度表現(xiàn)出高達244.3％信號增強，并將檢測時間從4 h縮短至50 min。條件優(yōu)化后的RecQE酶促 HCR/GO傳感平臺應用于檢測靶目標 let-7a的靈敏度實驗與特異性實驗當中，結(jié)果表明此傳感平臺對10 fM到2000 fM之間的目標let-7a具有良好的檢測線性關系，能夠靈敏的檢測低