基于氧化石墨烯和端粒酶的新型生物傳感技術的研究與應用.pdf

1、近年來，納米材料由于其獨特的光學和電化學性能，已成為當前研究的焦點，納米材料也在生物傳感器的研究中得到越來越廣泛的應用。納米材料與生物傳感器的結合，涉及到生物技術、信息技術、納米科學等多個學科，因此納米材料在生物傳感器中的研究為許多基礎研究提供了許多創(chuàng)新性的研究思路，同時對臨床檢測、醫(yī)學診斷、環(huán)境監(jiān)測等領域有著重要影響，也得到了前所未有的發(fā)展機遇。本文利用納米材料氧化石墨烯和金納米顆粒，開發(fā)了一系列成本低、操作簡單、靈敏度高的新型納米生

2、物傳感技術，成功實現(xiàn)了對核酸、蛋白質的高靈敏檢測和抗癌藥物的篩選。此外，針對當前癌癥標志物端粒酶檢測方法中存在的靈敏度較低、檢測時間較長，容易出現(xiàn)假陰性信號等問題，結合本實驗室已發(fā)展的方法和技術，開發(fā)了一些新穎的生物傳感策略用于端粒酶的靈敏檢測。其主要內容如下：
　　(1)在第2章中發(fā)展了一種新型的基于核酸外切酶Ⅲ輔助目標循環(huán)放大的生物傳感策略用于目標DNA高靈敏的檢測。在這種方法中，設計了一條標記有熒光基團的發(fā)夾狀信號探針，其3

3、’末端突出了7個堿基，此時核酸外切酶Ⅲ不能水解信號探針，信號探針吸附在氧化石墨烯表面上，熒光被氧化石墨烯猝滅。當存在目標DNA時，目標DNA的5’末端與信號探針的3’末端雜交，形成雙鏈結構的平齊末端，從氧化石墨烯表面上解離下來，熒光得到恢復，而核酸外切酶Ⅲ會從3’末端開始水解信號探針，而目標DNA的3’末端突出了6個堿基，目標DNA不會被核酸外切酶Ⅲ水解，被釋放出來進入下一個循環(huán)反應，繼續(xù)與發(fā)夾狀信號探針雜交，然后信號再被核酸外切酶Ⅲ水

4、解，這樣目標DNA就可以得到循環(huán)利用。該方法實現(xiàn)了對目標DNA的高靈敏、高特異性檢測，響應動態(tài)范圍為1 pM到50 nM，檢測下限可達1 pM，比傳統(tǒng)的DNA檢測方法要低3個數(shù)量級，同時該方法具有較好的堿基錯配識別能力。
　　(2)在第3章中建立了一個基于氧化石墨烯的通用的生物傳感平臺用于抗癌藥物的篩選。該方法以人類端粒DNA的重復序列為模板設計了一條標記有熒光的信號探針，信號探針會吸附在氧化石墨烯表面，從而猝滅熒光。當目標藥物出

5、現(xiàn)時，信號探針上的堿基與中藥單體之間通過π-π共軛作用和氫鍵作用形成分子內反平行的G-四股螺旋復合結構，從而使信號探針從氧化石墨烯表面上解離下來，熒光信號得到恢復，進而達到對抗癌抗腫瘤藥物篩選的目的。該方法對三類傳統(tǒng)中藥單體進行了篩選，結果發(fā)現(xiàn)黃酮類中藥單體能與信號探針形成G-四股螺旋復合結構，是一種潛在的抗癌藥物，同時該方法在發(fā)現(xiàn)新的抗癌藥物方面具有潛在的應用價值。
　　(3)為了進一步拓寬氧化石墨烯的應用領域，在第4章中，利用

6、氧化石墨烯優(yōu)越的負載能力，構建了一個通用的生物傳感平臺用于蛋白水解酶的檢測，并用于活細胞內蛋白水解酶的成像分析。這種生物傳感技術利用共價交聯(lián)的方法，將多肽信號探針固定到氧化石墨烯的表面，達到降低背景熒光的目的。當目標蛋白水解酶存在時，蛋白水解酶特異性地水解多肽信號探針，熒光基團從氧化石墨烯表面解離下，遠離氧化石墨烯，從而產生熒光信號。在這種方法中，氧化石墨烯一方面作為熒光猝滅劑，用來猝滅信號探針的熒光，另一方面，氧化石墨烯又作為多肽信號

7、探針的優(yōu)良載體，將多肽信號探針運送到腫瘤細胞的內部。當腫瘤細胞被誘導產生目標蛋白水解酶時，蛋白水解酶特異性地水解固定在氧化石墨烯表面的多肽信號探針，從而產生熒光成像信號。該方法實現(xiàn)了對目標蛋白水解酶caspase-3的靈敏、快速檢測，其線性范圍在7.25 ng/mL到362 ng/mL之間，同時也具有較好的選擇性，此外還可實現(xiàn)對多元目標蛋白水解酶的同時檢測。
　　(4)在第5章中，利用金納米顆粒具有優(yōu)越的熒光猝滅能力，建立了一種新

8、穎的生物傳感技術用于腫瘤細胞中端粒酶活性的檢測。該方法先將信號和巰基捕獲探針退火雜交形成雙鏈DNA，再將雙鏈DNA自組裝到金納米顆粒表面，得到DNA-納米金探針。巰基捕獲探針的3’端包含端粒酶擴增的引物序列，在目標端粒酶存在的條件下，引物進行擴增，擴增產物與捕獲探針上的互補序列形成分子內發(fā)夾結構，將信號探針置換下來，從而產生熒光信號。該方法實現(xiàn)了對目標端粒酶的靈敏檢測，動態(tài)響應范圍為100到30000個HeLa細胞，并且當HeLa細胞在

9、0到1600個范圍內時，熒光強度與HeLa細胞的個數(shù)呈現(xiàn)良好的線性關系。此外該傳感技術還可用于二價鉛離子高靈敏、高特異性的檢測，檢測下限可達2 nM。
　　(5)在第6章中，制備了一種基于構象變換的電化學DNA生物傳感器用于腫瘤細胞中端粒酶活性的檢測。該方法將3’端包含了端粒酶擴增引物序列的捕獲探針組裝到金電極表面，再將二茂鐵標記的信號探針與捕獲探針的5’端雜交。在目標端粒酶的作用下，引物進行擴增，擴增產物使得捕獲探針由線型轉換成

10、發(fā)夾結構，通過捕獲探針的構象變換，二茂鐵標記的信號探針遠離電極表面，從而使得電化學信號減弱。這種方法成功地實現(xiàn)了對腫瘤細胞中端粒酶活性的靈敏檢測，動態(tài)響應范圍為100到60000個HeLa細胞，并且在該范圍內峰電流信號與HeLa細胞個數(shù)的對數(shù)呈現(xiàn)良好的線性關系，同時該方法具有較高選擇性，線性范圍寬，高特異性等優(yōu)點。
　　(6)在第7章中，開發(fā)了一種基于T7核酸外切酶輔助目標循環(huán)的放大方法用于腫瘤細胞中端粒酶活性的高靈敏檢測。在該方

11、法中，設計了一條5’標記有熒光素(FAM)和中間標記有四甲基羅丹明(TAMRA)的Taqman探針，由于T7核酸外切酶對單雙鏈DNA具有較好的區(qū)分能力，幾乎不水解單鏈狀態(tài)的DNA，因此，在沒有目標端粒酶時，單鏈狀態(tài)的Taqman探針不被水解，體系的背景信號也很低。此外，T7核酸外切酶是從雙鏈DNA的5’端開始水解DNA，所以引物3，端的擴增產物不會被水解，從而得到進一步的循環(huán)利用，大大提高了目標檢測的靈敏度。該方法成功地實現(xiàn)了對端粒酶活