新型生物傳感技術(shù)用于端粒酶活性的檢測(cè).pdf

1、端粒酶是一種特殊的DNA聚合酶,具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性,能以自身的RNA為模板,以端粒3’末端為引物,合成端粒重復(fù)單元TTAGGG。在正常人體細(xì)胞中,端粒酶的表達(dá)較低。但是在惡性腫瘤細(xì)胞,端粒酶的表達(dá)較高(它能維持癌細(xì)胞端粒的長度,使其無限制擴(kuò)增)。迄今發(fā)現(xiàn)近90％的腫瘤細(xì)胞都有端粒酶活性,端粒酶是目前最廣譜的惡性腫瘤的預(yù)警標(biāo)志物,已成為當(dāng)今腫瘤診斷的新標(biāo)志物和腫瘤治療的新靶點(diǎn)。因此,對(duì)端粒酶的檢測(cè)具有重要意義。
　　 (1)第二章中

2、發(fā)展了一種利用納米金放大技術(shù)電化學(xué)方法用于端粒酶活性的檢測(cè)。該方法通過在金電極表面組裝一條巰基捕獲探針(包含端粒酶的引物序列),在端粒酶的作用下,對(duì)捕獲探針進(jìn)行擴(kuò)增,納米金標(biāo)記的DNA探針與擴(kuò)增序列互補(bǔ)雜交,利用電活性物質(zhì)亞甲基藍(lán)可以嵌入DNA雙鏈和吸附納米金表面的特點(diǎn)來實(shí)現(xiàn)信號(hào)的輸出,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物活性的檢測(cè)。該方法快速準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)單,靈敏度較高。
　　 (2)第三章中研制了一種基于外切酶放大的熒光生物傳感技術(shù)用于端粒酶活性

3、的檢測(cè)。該方法設(shè)計(jì)了一條端粒酶的引物探針,一條標(biāo)記有一個(gè)熒光基團(tuán)和一個(gè)猝滅基團(tuán)的Taqman探針。在端粒酶存在情況下,引物探針進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增序列與‘Taqman探針可以互補(bǔ)雜交,形成雙鏈。然后用T7核酸外切酶(一種只作用于雙鏈DNA,且沿5’→3’方向催化去除5’單核苷酸),沿雙鏈5’→3’方向催化去除5’單核苷酸,使熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)分開,從而熒光得到恢復(fù)。由于T7核酸外切酶只水解DNA雙鏈的5’單核苷酸,因此端粒酶的擴(kuò)增序列可以繼續(xù)

4、結(jié)合Taqman探針,可以循環(huán)利用,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)信號(hào)的循環(huán)放大,大大降低了檢測(cè)下限。該方法具有快速,選擇性好,靈敏度高,操作簡(jiǎn)單和背景干擾較低等優(yōu)點(diǎn)。
　　 (3)蝎型探針是一種特殊的分子信標(biāo),它除了具有分子信標(biāo)特有的高度特異性外,還具有本身的特征——防止擴(kuò)增產(chǎn)物之間的相互競(jìng)爭(zhēng)。第四章基于蝎型探針的特點(diǎn),設(shè)計(jì)了一種基于探針-靶雜交體的蝎型探針用于端粒酶活性的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了一條標(biāo)記有熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)的端粒酶引物的蝎型探針鏈,在退