基于信號(hào)放大技術(shù)的壓電生物傳感器制備及應(yīng)用.pdf

1、隨著分析科學(xué)的不斷發(fā)展,生命科學(xué)領(lǐng)域中的各種分析和檢測過程,越來越多地要借助于生物傳感技術(shù)獲取所需的信息。經(jīng)過40多年的不斷發(fā)展,隨著現(xiàn)代測量技術(shù)、分子生物學(xué)、生物電子學(xué)和仿生學(xué)的迅猛發(fā)展及相互結(jié)合,生物傳感技術(shù)在基礎(chǔ)研究、應(yīng)用研究、新產(chǎn)品開發(fā)和商品化等方面都取得了長足進(jìn)展。各種新型生物傳感器不斷涌現(xiàn),儀器性能不斷提高,目前報(bào)道的生物傳感器已有幾百種,在醫(yī)療保健、食品衛(wèi)生、環(huán)境監(jiān)測、國防與安全等方面已逐步推廣應(yīng)用。本研究論文針對(duì)當(dāng)前傳感

2、技術(shù)發(fā)展中的一些瓶頸問題,重點(diǎn)關(guān)注如何提高傳感器信號(hào)等問題。結(jié)合壓電免疫傳感分析技術(shù)簡便、快速、可實(shí)時(shí)輸出數(shù)據(jù)的特點(diǎn)及電化學(xué)傳感技術(shù)的靈敏度高的優(yōu)點(diǎn),利用納米材料的優(yōu)越性能及酶催化信號(hào)放大技術(shù)發(fā)展了幾種新型的生物傳感器,對(duì)黃曲霉毒素B1、人IgG、α-地貧突變基因、模擬DNA序列進(jìn)行了定量測定,所得結(jié)果對(duì)比傳統(tǒng)方法,在檢測的靈敏度、線性范圍方面都有所提高,并驗(yàn)證了技術(shù)的實(shí)用性。
　　 壓電免疫傳感器是結(jié)合了壓電效應(yīng)的高靈敏性和免

3、疫反應(yīng)的高特異性的一種生物傳感器,具有簡便、快速、靈敏、成本低、響應(yīng)譜廣、可實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)輸出等優(yōu)點(diǎn),在生物技術(shù)、臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測、食品工業(yè)、醫(yī)藥和軍事等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。我們利用酶和納米材料在生物傳感器中的應(yīng)用,結(jié)合有效的生物活性組分的固定方法,采用信號(hào)放大技術(shù)提高分析信號(hào)、降低檢測下限,提出了三種新型的壓電免疫傳感器。同時(shí),嘗試用石英晶體微天平作為敏感元件,在其表面固定具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的DNA探針,用于識(shí)別并結(jié)合目標(biāo)DNA序列產(chǎn)生相應(yīng)

4、的信號(hào)構(gòu)建一種簡單有效的DNA檢測方法。還提出了一種新的電化學(xué)檢測DNA的方法,以二茂鐵標(biāo)記的寡核苷酸構(gòu)建了一種簡單通用的信號(hào)打開型的分子開關(guān),實(shí)現(xiàn)了對(duì)DNA序列的無試劑檢測。主要內(nèi)容如下:
　　 (1)研制了一種簡單、快速、靈敏的壓電免疫傳感器,用于黃曲霉毒素B1的檢測。黃曲霉毒素B1是一種小分子物質(zhì),很難用壓電法直接檢測,本文采用間接競爭免疫法。納米金標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體用于放大響應(yīng)信號(hào)。在0.10～100 ngmL-1的范

5、圍內(nèi),該傳感器的響應(yīng)信號(hào)與AFB1濃度的對(duì)數(shù)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。該傳感器可以檢測到AFB1的最低濃度為0.01 ng mL-1,定量能力與經(jīng)典酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)相接近。該傳感器界面可用甘氨酸緩沖液可順利再生,并可重復(fù)使用至少9次而其響應(yīng)信號(hào)沒有明顯降低(第二章)。
　　 (2)發(fā)展了一種基于間接競爭免疫反應(yīng)和酶催化沉積放大的黃曲霉毒素B1壓電檢測方法。先在石英晶振表面包被一層3-巰基丙酸自組裝膜,再共價(jià)結(jié)合BSA-AF

6、B1偶聯(lián)抗原,接著待測物AFB1與BSA-AFB1偶聯(lián)抗原競爭結(jié)合鼠抗AFB1抗體,然后結(jié)合辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體。在H2O2存在時(shí),HRP酶催化氧化4-氯-1-萘酚生成不溶物4-氯-1-萘醌沉積在電極表面,引起顯著的質(zhì)量變化,從而導(dǎo)致明顯的頻率響應(yīng)。該傳感器可獲得黃曲霉毒素B1的濃度檢測范圍為0.01～10 ng mL-1。通過對(duì)模擬樣品的分析結(jié)果表明,該傳感器能夠有效地檢測牛奶樣品中AFB1的含量,可望用于實(shí)

7、際樣品檢測(第三章)。
　　 (3)提出了一種簡便的基于SiO2納米顆粒免疫凝集反應(yīng)的壓電傳感器對(duì)人IgG的直接檢測方法。待測物人IgG會(huì)同時(shí)被晶振表面固定的羊抗人IgG抗體和檢測體系中SiO2標(biāo)記的羊抗人IgG抗體識(shí)別,引起檢測體系中的SiO2在傳感界面上特異性凝集,從而引起晶振表面的巨大質(zhì)量變化和檢測介質(zhì)密度和粘度變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,該方法修飾的探針不僅能充分地減少背景干擾,而且能顯著地放大響應(yīng)信號(hào)。實(shí)驗(yàn)中,采用掃描電鏡(S

8、EM)考察了探針表面在發(fā)生免疫凝集反應(yīng)前后的形貌變化。此外,還考察了免疫凝集促進(jìn)劑PEG及離子強(qiáng)度控制劑NaCl的使用對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。該傳感器的頻率變化與人IgG濃度為正相關(guān)關(guān)系,其檢測下限為0.084μg mL-1(第四章)。
　　 (4)嘗試用石英晶體微天平作為敏感元件,在其表面固定具有發(fā)央結(jié)構(gòu)的DNA探針,用于識(shí)別并結(jié)合目標(biāo)DNA序列產(chǎn)生相應(yīng)的信號(hào)構(gòu)建一種簡單有效的DNA檢測方法。其特點(diǎn)在于結(jié)合使用限制性核酸內(nèi)切酶ECoRⅠ

9、及納米金標(biāo)記的檢測探針,能夠很好的降低背景值并有效增強(qiáng)信號(hào)。方案如下:先在石英晶振表面通過巰基自組裝固定一段具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的DNA探針,其發(fā)央部分能夠被內(nèi)切酶ECoRⅠ特異性識(shí)別并切割。再用巰基己醇封閉,然后與目標(biāo)DNA作用。如果待測體系中含有目標(biāo)DNA,則DNA探針的發(fā)央結(jié)構(gòu)打開且隨后的內(nèi)切酶對(duì)其沒有作用,并可以結(jié)合納米金標(biāo)記的檢測探針而使信號(hào)放大。否則,在沒有目標(biāo)DNA時(shí),發(fā)夾結(jié)構(gòu)的DNA探針可被酶切,與納米金標(biāo)記的檢測探針作用也不能

10、產(chǎn)生任何信號(hào)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,此方法是一種簡單實(shí)用、靈敏度高的適應(yīng)于DNA分析檢測的技術(shù)(第五章)。
　　 (5)在本工作中,我們提出了一種新的電化學(xué)檢測DNA的方法,以二茂鐵標(biāo)記的寡核苷酸構(gòu)建了一種簡單通用的信號(hào)打開型的分子開關(guān),實(shí)現(xiàn)了對(duì)DNA序列的無試劑檢測。這一方法實(shí)際應(yīng)用于基因突變導(dǎo)致α-地貧的分析檢測中,用于檢測染色體末端142編碼子(Hb Constant Spring codon142)單堿基突變(TAA→CAA)的