電化學多肽生物傳感器信號放大策略的研究.pdf

1、蛋白酶是一種水解蛋白質(zhì)或多肽的水解酶，它與人體代謝過程如細胞生長與死亡、組織重塑和免疫防御等有關(guān)，已作為生物標志物應用于臨床檢測。建立簡單、靈敏、特異和快速的生物標志物檢測方法，對疾病的預防、診斷和治療具有十分重要的意義。電化學生物傳感器是將特異性分子識別物質(zhì)例如抗體、酶、適體、多肽等固定在換能器上，以電化學信號為檢測信號的分析器件，在分析化學的研究領(lǐng)域中起著越來越重要的地位。將多肽作為分子識別物質(zhì)，與抗體和酶相比，它穩(wěn)定、可靠、成本低

2、，并且具有高的親和性，較強的生物活性等優(yōu)點，在蛋白酶生物標志物的檢測中得到人們的廣泛關(guān)注。本論文以多肽作為分子識別物質(zhì)，致力于設(shè)計不同的信號放大策略，構(gòu)建了一系列操作簡便、成本低廉的電化學多肽傳感器，實現(xiàn)對前列腺抗原（一種絲氨酸蛋白酶）、基質(zhì)金屬蛋白酶-2、基質(zhì)金屬蛋白酶-7的高靈敏檢測，具體工作如下：
　　1.基于帶正電荷的金納米粒子為信號增強劑檢測前列腺抗原的電化學多肽傳感器研究
　　大部分的電化學多肽傳感器是基于目標物

3、對標記信號標簽的多肽進行剪切而構(gòu)建的“信號衰減型”（signal-off）傳感器，其靈敏度受到限制，且易產(chǎn)生假陽性信號。當前，金屬納米粒子由于可以克服一些酶生物材料固有的不穩(wěn)定性問題，已被廣泛用于信號放大。本工作中，基于正電荷的金納米粒子作為信號增強劑構(gòu)建了一種“信號增強型”（signal-on）的高靈敏的電化學多肽傳感器。正電荷的金納米粒子修飾在分子識別元件多肽上，它吸附測試底液中帶負電荷的氧化還原探針鐵氰化鉀（[Fe(CN)6]3

4、/4 ），加速了電子間的傳遞，獲得一個較低電化學阻抗值。在目標物前列腺抗原（PSA）存在的條件下，PSA特異性地剪切多肽，從而使得正電荷的金納米粒子離開電極表面，在[Fe(CN)6]3 /4 底液中進行電化學阻抗分析時，得到了一個較大的電化學阻抗值。通過監(jiān)測電化學阻抗值的變化，此傳感器實現(xiàn)了對目標物PSA的高靈敏檢測。此外，傳感體系是基于目標物對多肽的特異性剪切所設(shè)計，具有較高的選擇性和靈敏度，為其他蛋白質(zhì)的分析提供了一個通用性的檢測方

5、法。
　　2.基于核酸外切酶輔助的循環(huán)放大策略檢測基質(zhì)金屬蛋白酶-2的電化學多肽傳感器研究
　　將目標物對肽鏈的剪切直接轉(zhuǎn)化為輸出DNA（output DNA），它可以進一步地結(jié)合各種DNA放大技術(shù)實現(xiàn)高效信號放大，提高傳感器的靈敏度。本工作中將多肽剪切事件轉(zhuǎn)換為DNA檢測，并結(jié)合核酸外切酶III（EXO III）輔助目標物循環(huán)信號放大策略構(gòu)建了一種超靈敏檢測基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）的電化學傳感器。所構(gòu)建的傳感體系可

6、總結(jié)以下幾個優(yōu)點：首先，“信號增強型”（signal-on）傳感器的設(shè)計，在一定程度上減小了由電極表面剝落或者污染導致的假陽性信號的產(chǎn)生；其次，把蛋白質(zhì)分析與DNA放大技術(shù)結(jié)合，有效地提高了傳感器的靈敏度；另外，基于金納米粒子（depAu）良好的導電性和葫蘆脲[7]與電活性物質(zhì)亞甲基藍（MB）之間強的主客體識別作用，采用CB[7]/depAu修飾的電極作為傳感界面有效地促進了電活性物質(zhì)的采集；最后，此方法還可以拓展到其他具有酶剪切活性的

7、蛋白質(zhì)的檢測。
　　3.基于多肽剪切誘導的級聯(lián)信號放大策略檢測基質(zhì)金屬蛋白酶-7的電化學多肽傳感器研究
　　多肽剪切事件可以直接轉(zhuǎn)化為輸出DNA（output DNA），然而，output DNA通常帶有氨基酸殘基，其位阻效應會影響DNA的放大效率。為了解決這個問題，在本工作中，以指數(shù)放大反應（EXPAR）作為模型，通過設(shè)計一個兩段式的DNA模板，構(gòu)建了一個高效的 DNA放大體系用于高靈敏檢測基質(zhì)金屬蛋白酶-7（MMP-7）

8、?；谶@個兩段式的DNA模板，output DNA作為觸發(fā)劑1（trigger1）最先引發(fā)了一個低效率的EXPAR，反應過程中不僅獲得部分產(chǎn)物DNA(S1)，還產(chǎn)生了與output DNA具有相同核苷酸序列的觸發(fā)劑2（trigger2）。由于trigger2不包含任何氨基酸殘基，它繼續(xù)誘導了一個額外的，高效的EXPAR放大，迅速地獲得大量的產(chǎn)物S1。產(chǎn)物S1作為催化劑進一步誘導了催化發(fā)夾自組裝反應（CHA），獲得了級聯(lián)放大的電化學信號，