基于自組裝和目標(biāo)物循環(huán)信號放大的新型電化學(xué)生物傳感器研究.pdf

1、近幾年來，快速、簡單、靈敏的生物分子檢測在臨床診斷、食品分析、生物恐怖主義的防御和環(huán)境監(jiān)測等方面變得日益重要。電化學(xué)生物傳感器由于具有簡單、靈敏、成本低并可廣泛運用于不同領(lǐng)域的固有優(yōu)勢而受到越來越多的關(guān)注。為了實現(xiàn)高靈敏的生物檢測，不同信號放大方法被用于傳感器的構(gòu)建中。因此，本論文從簡化操作步驟出發(fā)，主要側(cè)重于自組裝（電極表面單分子層的組裝、納米材料的組裝及DNA自組裝技術(shù)）和目標(biāo)物(DNA、生物小分子)循環(huán)技術(shù)作為信號放大手段的研究，

2、創(chuàng)造性開發(fā)分析新平臺。并對其相應(yīng)原理及性能等進行了全面地探索和研究。研究工作可分為以下幾個部分:
　　1.量子點層層自組裝信號放大標(biāo)記物構(gòu)建基于適體的高靈敏電致化學(xué)發(fā)光凝血酶傳感器
　　我們提出了一種新型電致化學(xué)發(fā)光信號放大納米復(fù)合材料的制備方法及應(yīng)用實例。將生物素和鏈霉親和素分別修飾的碲化鎘量子點通過層層自組裝的方式自組裝到聚苯乙烯微球表面后與核酸適體交聯(lián)制各電致化學(xué)發(fā)光信號放大探針。樣品中待測目標(biāo)物凝血酶與電極表面固定的

3、核酸適體探針和電致化學(xué)發(fā)光信號放大探針發(fā)生生物分子識別后形成夾心式結(jié)構(gòu)。相對于傳統(tǒng)單個量子點標(biāo)記的凝血酶電致化學(xué)發(fā)光檢測，該種方法在每一次適體/凝血酶結(jié)合事件中可引入為數(shù)眾多的發(fā)光體量子點而顯著增強電致化學(xué)發(fā)光信號，從而實現(xiàn)對凝血酶的高靈敏檢測，其檢測限達到350 fmol L-1。該種新型信號放大檢測策略也能廣泛地運用于其他重要生物分子（例如:蛋白質(zhì)，肽類，氨基酸，細胞等）的超低濃度檢測。因此，該種信號放大策略對于疾病的早期診斷具有較

4、大的應(yīng)用潛力。
　　2.基于發(fā)夾形DNA和石墨烯/納米金復(fù)合材料的目標(biāo)物循環(huán)放大高靈敏免標(biāo)記阻抗檢測DNA的研究
　　基于酶輔目標(biāo)物循環(huán)、石墨烯/納米金復(fù)合材料及發(fā)夾形DNA探針，我們構(gòu)建了一種簡單高靈敏的電化學(xué)交流阻抗法用于免標(biāo)記DNA檢測。目標(biāo)DNA與自組裝于石墨烯/納米金復(fù)合材料修飾印刷碳電極表面的發(fā)夾形DNA探針雜交。外切酶Ⅲ(ExoⅢ)可以選擇性剪切與目標(biāo)物雜交打開形成互補雙鏈結(jié)構(gòu)的發(fā)夾形DNA探針，從而釋放出目標(biāo)

5、DNA。被釋放出的DNA再次與余下的捕獲探針雜交，在ExoⅢ存在下剪切DNA捕獲探針。結(jié)果，痕量的目標(biāo)物就可以移除電極表面上大量的發(fā)夾形DNA捕獲探針，使得阻抗信號明顯降低。由于高效的催化性目標(biāo)物循環(huán)信號放大作用，可以實現(xiàn)飛摩級水平的檢測。因此，這種傳感方法能推廣應(yīng)用于免標(biāo)記電化學(xué)阻抗法檢測痕量DNA的研究中。
　　3.基于原位雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)信號放大高靈敏電致化學(xué)發(fā)光檢測DNA的研究
　　運用一種新的通過原位雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(HC

6、R)信號放大的高靈敏電致化學(xué)發(fā)光方法檢測特異性DNA序列，檢測限達到飛摩級水平。將DNA捕獲探針自組裝于金電極表面構(gòu)建傳感界面。待測液中的目標(biāo)DNA與電極表面的探針DNA雜化之后，將其與兩條發(fā)夾結(jié)構(gòu)的輔助DNA孵育，通過HCR反應(yīng)在電極表面原位形成長的雙鏈DNA結(jié)構(gòu)。這些DNA雙鏈體能結(jié)合大量的電致發(fā)光信號分子(Ru(phen)32+)從而放大分析信號。由于該方法結(jié)合HCR反應(yīng)信號放大和電致化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)本身的高靈敏性，因此可以實現(xiàn)飛

7、摩級的DNA檢測。同時，我們的檢測方法還對單堿基錯配具有較高的選擇性。這些特性使得該方法成為高靈敏DNA檢測的有效技術(shù)之一。
　　4.一種基于酶輔助目標(biāo)物循環(huán)與超夾心組裝的新型集成信號放大策略用于超靈敏電化學(xué)DNA檢測
　　這里，我們提出了一種高靈敏檢測特異性DNA序列的電化學(xué)方法，該方法將N.BstNBⅠ(一種核酸內(nèi)切酶)-輔助的目標(biāo)物循環(huán)放大和DNA超夾心自組裝信號增強統(tǒng)一于一體。目標(biāo)DNA與固定在磁珠表面的發(fā)夾形探針雜

8、交形成部分雙鏈結(jié)構(gòu)和N.BstNBⅠ特異性酶切位點。N.BstNBⅠ酶選擇性剪切雜交的DNA探針并釋放出目標(biāo)DNA，被釋放的目標(biāo)序列再與其他發(fā)夾形探針雜交從而引發(fā)目標(biāo)物循環(huán)，并產(chǎn)生大量被剪切的中間體DNA片段。然后，大量的中間體DNA片段在電極表面充當(dāng)了組裝輔助探針形成DNA超夾心結(jié)構(gòu)的橋梁。形成的DNA超夾心在電極表面靜電結(jié)合大量氧化還原探針(Ru(NH3)63+)，顯著放大用于DNA定量的分析信號。因此，將酶輔助目標(biāo)物循環(huán)與超夾心組

9、裝集成于一體，為低至飛摩水平(0.36 fmol L-1)的超靈敏電化學(xué)DNA檢測提供了一種有效的信號放大途徑。此外，我們提出的傳感策略不僅具有高靈敏性和優(yōu)良的選擇性，還便于操作，因為避免了額外的化學(xué)標(biāo)記步驟并利用了磁珠便于分離富集的優(yōu)點，這有利于DNA檢測過程，使得該方法具有較大的運用于基因相關(guān)疾病早期診斷的潛在可能性。
　　5.目標(biāo)物誘導(dǎo)適體/DNA酶超夾心納米結(jié)構(gòu)自動解組裝電致發(fā)光信號增強的靈敏性O(shè)TA檢測
　　自組裝

10、DNA納米結(jié)構(gòu)是納米科學(xué)里最熱門的研究領(lǐng)域之一，然而，其運用于生物傳感器的研究還處于萌芽階段。基于目標(biāo)物誘導(dǎo)對適體/DNA酶超夾心納米結(jié)構(gòu)的自動解組裝作用，我們提出了一種高靈敏電致化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測赫曲霉毒素A(OTA)的策略。自組裝到金電極表面的適體/DNA酶超夾心納米結(jié)構(gòu)對O2/S2O82-體系的ECL具有顯著的淬滅作用。目標(biāo)物OTA和核酸外切酶RecJf的出現(xiàn)使該納米結(jié)構(gòu)自動解組裝及OTA重復(fù)利用，導(dǎo)致被淬滅的ECL得以有效恢