基于納米材料和環(huán)糊精的新型DNA電化學(xué)生物傳感器的研究.pdf

1、隨著基因的結(jié)構(gòu)與功能的研究不斷深入,特別是人類基因組計劃(HGP)的發(fā)展,基因的分離及分析檢測在衛(wèi)生防疫、醫(yī)學(xué)診斷、藥物研究、環(huán)境科學(xué)及生物工程等領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用。許多新的生物技術(shù)的開發(fā),為發(fā)展高靈敏度、高特異性的生物分析檢測方法注入了活力,其中利用DNA分子間的特異性互補配對規(guī)律發(fā)展起來的各種DNA生物傳感技術(shù),引起了國內(nèi)外生物分析工作者的廣泛關(guān)注。電化學(xué)DNA檢測方法以其靈敏度高、輕巧便宜、攜帶方便、耗能少、能與現(xiàn)代微電子

2、技術(shù)聯(lián)用,易于實現(xiàn)微型化等優(yōu)點,受到了研究者們的廣泛關(guān)注,儼然成為當今生物學(xué)、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的前沿性課題。 納米技術(shù)的出現(xiàn)為納米材料在分析化學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展和應(yīng)用開辟了新的思路。納米顆粒的比表面積大、表面反應(yīng)活性高、催化效率高、吸附能力強等優(yōu)異性質(zhì),在催化、光吸收、生物醫(yī)藥、磁介質(zhì)及新材料等方面得到了廣泛的應(yīng)用,為生物醫(yī)學(xué)研究提供了新的研究途徑,同時也推動了化學(xué)和生物傳感器的迅速發(fā)展。納米粒子的獨特性質(zhì)與生物分子雜交反應(yīng)和電化學(xué)檢測方法相

3、結(jié)合,使其應(yīng)用范圍更加廣闊(例如：納米生物電子)。納米粒子生物分子連接可能用于DNA疾病的診斷,并且對生物分析化學(xué)產(chǎn)生巨大的影響。 超分子化學(xué)是基于分子間的非共價鍵相互作用而形成的分子聚集體化學(xué),在與材料科學(xué)、生命科學(xué)、信息科學(xué)、納米科學(xué)與技術(shù)學(xué)科的交叉融合中,超分子化學(xué)已發(fā)展成為超分子科學(xué)。并成為創(chuàng)造新物質(zhì)、實現(xiàn)新功能的一種新的重要途徑,被認為是21世紀新概念和高技術(shù)的重要源頭之一。環(huán)糊精作為超分子化學(xué)的重要主體化合物以其獨特

4、的性質(zhì)而倍受關(guān)注。對它的研究也逐漸從主客體識別形成包合物的機理轉(zhuǎn)移到對其在分析化學(xué)、醫(yī)藥、環(huán)境保護和傳感器等領(lǐng)域的應(yīng)用研究中。 本論文的主要創(chuàng)新之處就是將納米技術(shù)、層層組裝技術(shù)、超分子包合作用等與電化學(xué)分析技術(shù)相結(jié)合用于核酸分子雜交或凝血酶蛋白的分析檢測,研制具有高靈敏度高選擇性的新型電化學(xué)生物傳感器,成功地應(yīng)用于對特定序列DNA片斷的選擇性測定和對DNA鏈中的堿基尤其是單個堿基突變的快速、靈敏和準確的識別,為基因的快速分析測定

5、提供了一種簡便、快捷、廉價的檢測裝置。第一章緒論首先系統(tǒng)介紹了DNA生物傳感器及其研究進展。介紹了DNA生物傳感器的原理(包括DNA探針及其分子識別原理和DNA在固體基質(zhì)表面的固定化)和分類(包括電化學(xué)DNA生物傳感器,壓電DNA生物傳感器及光學(xué)DNA生物傳感器1,其中著重介紹了電化學(xué)DNA生物傳感器的原理和研究進展,敘述了DNA電化學(xué)傳感器在基因檢測等方面的應(yīng)用,對今后的發(fā)展方向和趨勢進行了展望。接著介紹了納米材料在生物傳感器中的一系

6、列應(yīng)用。最后闡述了本論文的目的和意義,指出論文的創(chuàng)新之處及主要研究內(nèi)容。 第二章基于納米顆粒SiO2包裹Ru(bpy)32+標記的DNA電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器研究首次以SiO2包裹Ru(bpy)32+標記DNA分子,制備成高效的電致化學(xué)發(fā)光探針,實現(xiàn)對目標DNA的高靈敏度特異性識別。我們合成了SiO2包裹Ru(bpy)32+核殼式納米顆粒,以此作為新型的ECL標記物。利用一個納米顆粒中可包裹多個Ru(bpy)32+分子來達到放大

7、ECL信號的目的,為分析檢測更高的靈敏度。根據(jù)DNA的堿基互補配對原則、核酸適配體對蛋白質(zhì)的特異性識別能力,采用Ru(bpy)32+-SiO2納米顆粒作為標記物設(shè)計ECL生物傳感器,希望能將ECL方法、納米顆粒帶來的高靈敏度與生物識別的高特異性進行有機的結(jié)合,實現(xiàn)對DNA序列以及蛋白質(zhì)進行高靈敏、高特異性的研究分析。 第三章基于鈀納米粒子/碳納米管增強的DNA電化學(xué)生物傳感器研究首次將鈀納米顆粒與羧基化碳納米管結(jié)合用于DNA生物

8、傳感器的研究,借助鈀的良好催化活性和碳納米管的較大的比表面積、極強的導(dǎo)電性等實現(xiàn)超靈敏的DNA檢測。合成了直徑為3～4nm的鈀(Pd)納米粒子,將其與末端羧基化的多壁碳納米管(COOH-MWCNT)結(jié)合,制得靈敏度增強的電化學(xué)DNA生物傳感器。首先將一定量的Nafion、COOH-MWCNT及Pd納米粒子的混合液涂在玻碳電極(GCE)表面,制得MWCNT/Pd修飾電極,對該電極進行了電化學(xué)特性的研究。然后通過5’端氨基修飾的寡聚核苷酸(

9、5'-NH2-DNA)與碳納米管末端的羧基(-COOH)之間形成酰胺鍵而將ssDNA固定在MWCNT/Pd修飾電極上。與目標DNA雜交后,以亞甲基藍(MB)為電化學(xué)雜交指示劑,實現(xiàn)對互補序列、非互補序列的識別和電化學(xué)測定。在亞甲基藍的電化學(xué)反應(yīng)中,由于碳納米管具有很好的電子傳遞能力同時Pd納米粒子具有很好的催化活性,可以使電化學(xué)DNA生物傳感器的靈敏度大大提高。對目標DNA的檢測下限可以達到1.2×10-13 M。第四章基于層層組裝技術(shù)

10、實現(xiàn)DNA放大檢測的電化學(xué)生物傳感器研究將層層組裝技術(shù)用于金納米顆粒標記的DNA生物傳感器的研究中,通過電極表面的多次電荷翻轉(zhuǎn)達到富集大量的目標DNA分子的目的,以此獲得放大的DNA雜交信息。本文介紹了聚二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽(PDDA)分子與DNA經(jīng)過層層組裝(layer-by-layer,LBE)的方法,以DNA探針分子上標記的金納米顆粒為電化學(xué)檢測手段,實現(xiàn)對目標DNA雜交信號的放大。運用交流阻抗技術(shù)(EIS)和紫外吸收光譜法(V

11、-Vis)對LBL的過程進行研究,實驗結(jié)果表明多層膜能夠均勻規(guī)則地組裝在聚吡咯(PPy)修飾的電極表面,并通過層層組裝將雜交信號放大。在優(yōu)化條件條件下,組裝層為6層時,其檢測限達到3.20×10-14 M,該方法具有高靈敏度和特異性。通過采用干擾序列消除非特異性吸附,這種傳感器表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。 第五章基于β-環(huán)糊精主客體識別作用的DNA電化學(xué)生物傳感器研究首次將主客體識別作用應(yīng)用于DNA生物傳感器的研究中,以β-環(huán)糊

12、精對客體分子間甲基苯甲酸(mTA)的高效識別性成功地實現(xiàn)了對DNA分子的檢測。將β-環(huán)糊精采用電化學(xué)方法聚合在氮乙酰基苯胺修飾的玻碳電極表面,以mTA作為客體分子標記于5’端氨基修飾寡聚核苷酸片段上,通過電化學(xué)交流阻抗對β-環(huán)糊精修飾電極捕獲mTA標記的DNA進行了表征。其結(jié)果顯示出該電極對mTA標記的DNA探針分子具有很強的包絡(luò)作用,能夠通過主客體的識別將ssDNA和dsDNA捕獲到電極表面。分別采用金納米顆粒標記探針和以亞甲基蘭為雜

13、交指示劑對目標DNA檢測,均能通過主客體識別的方法獲得良好的檢測限。研究表明,β-環(huán)糊精修飾電極具有優(yōu)良的再生性,可重復(fù)多次用于DNA的雜交檢測。第六章基于金納米顆粒聚集體富集亞甲基蘭的DNA與蛋白質(zhì)的電化學(xué)生物傳感器的研究首次采用金納米顆粒標記特定序列的寡聚核苷酸片段,設(shè)計了即可用于DNA檢測又能實現(xiàn)對特殊蛋白質(zhì)放大檢測的研究方法。采用特殊設(shè)計的兩段寡聚核苷酸片段,其一端均以金納米顆粒標記,另外一端均為含有一段可以與凝血酶蛋白產(chǎn)生特異

14、性結(jié)合的核酸適配體(適體)片段。當與目標分子(DNA或凝血酶蛋白)產(chǎn)生特異性結(jié)合作用時,該探針能與目標分子形成含有多個金納米顆粒聚集體,將金納米顆粒聚集體自組裝在硫代三聚氫酸修飾的金電極表面,通過探針上的鳥嘌呤富集MB分子,實現(xiàn)對目標物的檢測。探針上識別凝血酶的寡聚核苷酸片段含有多個鳥嘌呤堿基,它能與MB有很強的結(jié)合作用,因此富含鳥嘌呤的探針能夠富集大量的MB分子在納米顆粒聚集體上,同時,由于金納米顆粒聚集體能加速MB氧化還原反應(yīng)過程的