用于LM基因檢測(cè)的基于金納米信號(hào)放大的電化學(xué)DNA生物傳感器研究.pdf

1、StudyofElectrochemicalDNABiosensorBasedonSignalAmplificationbyGoldNanoparticlesforthedetectionofLMHU久NGShanshanAthesissubmittedinpartialsatisfactionoftheRequirementsforthedegreeofMasterofEngineeringinFoodSciencemCentralS

2、outhUniversityofForestryandTechnology498ShaoshanSouthRoad，TianxinDistrictChangshaHunan410004，PRCHINASupervisorProfessorLIZhonghaiMay2014摘要單增李斯特菌(LM)廣泛存在于肉類、乳制品、蔬菜、海產(chǎn)品、冷藏食品及熟食制品等食品中，是僅次于致病性大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、志賀氏菌的第四大食源性致病菌。近年來(lái)單增李斯

3、特菌引起的食源性疾病在全球范圍內(nèi)頻頻發(fā)生，因此，研究食品中單增李斯特菌的有效檢測(cè)方法具有重要意義。目前，單增李斯特菌的檢測(cè)方法主要有傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)及生化鑒定法、PCR檢測(cè)法、免疫學(xué)檢測(cè)法等，這些方法基本上都存在檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、操作繁瑣、成本昂貴等不足，不適合現(xiàn)場(chǎng)快速測(cè)定和大量樣本的分析。電化學(xué)DNA生物傳感器是目前發(fā)展起來(lái)的可對(duì)食品中病原菌基因進(jìn)行檢測(cè)的一種方法，具有檢測(cè)快速、操作簡(jiǎn)單、成本低、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。本文采用循環(huán)伏安法、交流阻抗法

4、、差分脈沖伏安法等電化學(xué)分析方法構(gòu)建了兩種電化學(xué)DNA生物傳感器，用于單增李斯特菌hlyA毒理基因片段的檢測(cè)，主要內(nèi)容如下：1采用檸檬酸鈉還原法制備了分散均勻的粒徑約15nm的金納米粒子(AuNPs)。將1，4苯二甲硫醇(BDMT)作為連接裸金電極與AuNPs的中間物質(zhì)，制備了層層組裝的SSDNA／AuNPs／BDMT／Au電極；將ssDNA／AuNPs／BDMT／Au電極置于6一巰基己醇(MCH)溶液中2h，以封閉電極表面空白位點(diǎn)。分

5、別采用循環(huán)伏安法與交流阻抗法表征了各修飾電極的組裝過(guò)程，表明BDMT、AuNPs、SSDNA、MCH均成功組裝到了金電極表面。2通過(guò)是否對(duì)ssDNA／AuNPs／BDMT／Au電極進(jìn)行6一巰基己醇(MCH)封閉處理，研究了MCH對(duì)探針DNA修飾電極的作用。采用交流阻抗法與差分脈沖伏安法對(duì)兩種雜交后的電極進(jìn)行表征，結(jié)果表明，MCH可封閉電極表面的空白位點(diǎn)，有效調(diào)控電極表面的DNA固定密度，減少非特異性吸附的發(fā)生，從而提高雜交效率。通過(guò)是否

6、在金電極表面組裝金納米粒子，采用交流阻抗測(cè)試研究了AuNPs對(duì)所制備的生物傳感器的放大作用。結(jié)果表明，AuNPs能夠顯著增加電極表面探針DNA分子的固定數(shù)量，放大檢測(cè)信號(hào)，并提高電化學(xué)DNA生物傳感器的檢測(cè)靈敏度。3制備了以道諾霉素(DNR)為雜交指示劑的電化學(xué)DNA生物傳感器。對(duì)DNA的雜交條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果如下：最適雜交溫度40℃；雜交溶液離子強(qiáng)度15mmol／L；雜交時(shí)間40min。并對(duì)指示劑DNR的嵌入條件進(jìn)行了優(yōu)化：最適DN

7、R濃度005mmol／L；最佳嵌入時(shí)間15min；DNR溶液最適pH值65。以差分脈沖伏安法為測(cè)試方法，通過(guò)對(duì)雜交后DNR產(chǎn)生的峰值電流進(jìn)行分析，實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)DNA的定量檢測(cè)。在目標(biāo)DNA濃度為10x10。13～1010‘8mol／L范圍內(nèi)，DNR的峰電流值與目標(biāo)DNA濃度的對(duì)數(shù)呈良好線性關(guān)系，線性回歸方程為I(A)=3745701735109C(mol／L)，線性相關(guān)系數(shù)R2=O9958，檢出限為378x1014mol／L。所制備的電化