基于聚合酶的核酸擴(kuò)增技術(shù)及其在microRNA檢測中的應(yīng)用研究.pdf

1、MicroRNAs（miRNAs）是一類非蛋白編碼的短小的內(nèi)源性RNAs，是重要的基因表達(dá)的后轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，它在細(xì)胞發(fā)育、新陳代謝、細(xì)胞凋亡和腫瘤的發(fā)生等生物過程中都起著至關(guān)重要的作用。核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)主要是通過生成大量的目標(biāo)物的復(fù)制序列或者是將目標(biāo)物轉(zhuǎn)化為其他的特殊的核酸序列或信號(hào)分子，達(dá)到擴(kuò)增檢測目標(biāo)物的目的。目標(biāo)物或信號(hào)的擴(kuò)增過程致使該檢測技術(shù)具有較高的靈敏度和選擇性。然而，大多核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)復(fù)雜，不便于操作，而且熒光

2、標(biāo)記探針和特殊的DNA或RNA酶的使用大大增加了檢測成本，這限制了它們的應(yīng)用范圍。因此，迫切需要研發(fā)新的經(jīng)濟(jì)方便、靈敏度高且選擇性好的miRNA檢測方法。本論文致力于研究基于聚合酶的核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)，主要設(shè)計(jì)了一系列簡單、快速、靈敏且經(jīng)濟(jì)的miRNA檢測新方法，為癌癥的早期診斷、介入治療以及抗癌藥物的發(fā)現(xiàn)提供了研究基礎(chǔ)。主要研究內(nèi)容如下：
　　1、圍繞本論文的研究內(nèi)容，對(duì)miRNAs、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdTase）和用于mi

3、RNA檢測的核酸擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行了綜述。首先，對(duì)miRNAs的起源、作用機(jī)制和生物學(xué)功能進(jìn)行了總結(jié)，并著重論述了miRNAs在細(xì)胞發(fā)育、細(xì)胞分化以及在免疫系統(tǒng)、癌癥和作為致癌基因或抑癌基因方面的重要作用和意義。然后，簡要介紹了DNA聚合酶的重要性和分類，著重論述了TdTase聚合酶的活性分析。最后，綜述了幾種常用的miRNA核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)，包括聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增檢測技術(shù)、滾環(huán)擴(kuò)增檢測技術(shù)、鏈置換擴(kuò)增檢測技術(shù)、雙鏈特異性酶擴(kuò)增檢測技術(shù)以及雜交

4、鏈反應(yīng)擴(kuò)增檢測技術(shù)等。
　　2、提出一種新穎簡單通用的分支級(jí)聯(lián)酶擴(kuò)增（branched cascade enzymatic amplification，BCEA）技術(shù)，旨在通過目標(biāo)miRNA和捕獲探針DNA的直接雜交啟動(dòng)聚合酶的催化反應(yīng)，并通過第二引物的引入產(chǎn)生大量的雙鏈分支進(jìn)而提高擴(kuò)增效率，利用SYBR GreenⅠ（SG）作為熒光信號(hào)對(duì)miRNAs進(jìn)行定量檢測。本方法中SG的熒光強(qiáng)度隨目標(biāo)miRNA濃度（1fM-10pM）的增

5、加呈指數(shù)擴(kuò)增，對(duì)miRNA的檢測下限為0.1fM。本方法不僅可以有效區(qū)分miRNAs之間的單堿基錯(cuò)配，還可以直接用于癌癥細(xì)胞提取物中miRNAs的靈敏檢測。本方法的優(yōu)勢在于：首先，降低了實(shí)驗(yàn)操作的復(fù)雜性和分析成本；其次，對(duì)miRNAs的檢測限非常低且選擇性高，并可直接用于癌癥細(xì)胞提取物中miRNAs的高靈敏檢測，在臨床診斷中具有很大的應(yīng)用潛力；最后，本文提出的BECA方法簡單、擴(kuò)增效率高且通用性好，可拓展應(yīng)用于其他傳感技術(shù)。
　　

6、3、發(fā)展一種基于Hg2+輔助的雙聚合酶等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)（Hg2+-assistant dual polymerase isothermal nucleic acid amplification，Hg2+-DPINA）的miRNA檢測方法。目標(biāo)miRNA與模板DNA雜交，然后在Klenow片段和TdTase兩種聚合酶的作用下催化生成聚T堿基序列，加入Hg2+形成T-Hg2+-T雙鏈結(jié)構(gòu)，SG熒光染料可插入到此雙鏈結(jié)構(gòu)中使SG的熒光顯著增強(qiáng)

7、，而SG熒光增強(qiáng)的程度與miRNAs的濃度呈正相關(guān)，據(jù)此實(shí)現(xiàn)miRNAs的靈敏檢測。本方法對(duì)miRNAs檢測的線性范圍為10pM-10nM，其檢測下限為5pM。本方法的優(yōu)勢在于：首先，Hg2+的引入可以直接形成T-Hg2+-T雙鏈結(jié)構(gòu)，避免了因雜交引起的錯(cuò)配或發(fā)生鏈置換反應(yīng)，提高了雙鏈的結(jié)合效率；其次，本方法采用的“turn-on”模式可有效提高檢測靈敏度和減少假陽性信號(hào)；最后，本方法可用于識(shí)別檢測細(xì)胞溶解產(chǎn)物中的miRNA序列，具有良

8、好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
　　4、將雙聚合酶催化延伸胸腺嘧啶（enzymatically engineered primer extension poly-thymine，EPEPT）機(jī)制與納米材料的原位生成技術(shù)相結(jié)合，發(fā)展了一種以聚胸腺嘧啶為模板原位生成熒光CuNPs的miRNA檢測方法。本方法基于聚合酶Klenow片段和TdTase的共同催化作用，將miRNA與模板DNA雜交后有效延伸成長度較長的聚胸腺嘧啶序列，加入Cu2+和抗壞血

9、酸鈉，即以此聚胸腺嘧啶序列為模板原位生成紅色熒光的polyT-CuNPs，polyT-CuNPs的熒光強(qiáng)度與miRNA濃度的對(duì)數(shù)成正比，據(jù)此實(shí)現(xiàn)miRNAs的低背景和高靈敏檢測。本方法對(duì)miRNA檢測的線性范圍為1pM-1nM，檢測下限為100fM，應(yīng)用于多種細(xì)胞溶解產(chǎn)物中miRNAs的檢測，獲得滿意結(jié)果。此外，由于本方法生成的polyT-CuNPs可發(fā)射強(qiáng)紅色熒光并具有良好的Stokes位移，因此在紫外燈照射下可以實(shí)現(xiàn)miRNAs的可

10、視化檢測，在熒光成像、臨床診斷和生物化學(xué)分析等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
　　5、將富G堿基序列與Tb3+之間的共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)應(yīng)用于miRNA檢測中，提出一種新穎的基于稀土離子熒光增強(qiáng)的miRNA分析方法，并用于復(fù)雜樣品中miRNAs的良好檢測。利用配體敏化Tb3+優(yōu)良的Stokes位移和強(qiáng)而尖銳的發(fā)射光譜等光學(xué)性質(zhì)，構(gòu)建基于富鳥嘌呤DNA敏化Tb3+熒光檢測miRNAs的方法。首先由目標(biāo)miRNA誘導(dǎo)啟動(dòng)聚合反應(yīng)，通過兩個(gè)聚合酶

11、的聯(lián)合作用，生成大量的長鏈富G堿基DNA序列，富G堿基DNA序列通過共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)增強(qiáng)Tb3+的熒光。隨著目標(biāo)miRNA濃度的增加（0-1nM），Tb3+在545nm處的熒光發(fā)射光譜強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，據(jù)此可實(shí)現(xiàn)對(duì)miRNAs的檢測，檢測下限為100fM。在以上基礎(chǔ)上，建立了基于Tb3+和半導(dǎo)體QDs雙發(fā)射比率熒光傳感平臺(tái)用于miRNAs的靈敏檢測。先利用偶聯(lián)技術(shù)將QDs與捕獲探針 pDNA耦合形成QDs-pDNA復(fù)合物，并以QDs的熒光發(fā)