用于食品的核酸擴增檢測技術研究.pdf

1、核酸擴增檢測技術是一種高度靈敏的分子診斷技術，在食品安全檢測領域具有十分重要的地位。但當前的核酸擴增技術在滿足結果準確可靠的同時，一方面正在向操作簡便、成本低廉、儀器簡單、反應快速的方向發(fā)展，以實現(xiàn)樣本的現(xiàn)場快速檢測;另一方面又要求減少勞動力參與、實現(xiàn)樣本的自動化檢測、從而能夠同時檢測大量樣本。因此，迫切需要新的方法來滿足當前核酸擴增檢測技術的需求。為了開發(fā)簡單、快速的食品安全檢測方法，本論文針對核酸擴增檢測技術的不同模塊（核酸提取、核

2、酸擴增和產物檢測），分別開發(fā)了不同的方法，主要研究內容、結果及相關結論如下:
　　(1)針對核酸提取步驟繁瑣，不便于大通量操作的問題，開發(fā)了基于磁性微球的大米基因組DNA提取方法。該方法利用二氧化硅修飾的四氧化三鐵(Fe3O4@SiO2)磁性微球對DNA進行提取，在以2％的月桂酰肌氨酸鈉(SLS)作為裂解液，5M的異硫氰酸胍(GITC)作為結合液提取DNA時具有最高的產率，且其提取的DNA與商業(yè)化Mag-Bind(R)Plant

3、DNA提取試劑盒提取的DNA用于實時熒光PCR擴增的循環(huán)閾值(Treshold cycle，Ct)相當;所建立的磁性微球提取方法分別用于從摻有不同含量轉基因成分的生米和熟米中提取DNA，并將提取到的DNA用于實時熒光PCR擴增，最低可檢測生米中0.01％轉基因成分及熟米中0.1％轉基因成分，且Ct值與轉基因成分含量的對數值具有良好的線性反相關關系(R2=0.998)，表明該方法提取的DNA純度能夠滿足熒光PCR的定量需求。綜上，所開發(fā)的

4、磁性微球核酸提取方法操作簡單、快速，提取的DNA樣本能夠滿足檢測需求。
　　(2)針對轉基因作物田間檢測樣品預處理需要操作快速簡易及田間檢測供電困難的問題開發(fā)了無需供電設備參與，也無需對核酸樣本進行純化的轉基因作物快速檢測方法，結果表明:使用0.5M NaOH對水稻葉片進行4min處理后所得裂解液可直接用于LAMP擴增(Tt=12.3);當反應溫度在51.9℃-66.6℃間時，陽性樣本在40min內都能被LAMP擴增;三種保溫性能

5、不同的保溫杯作為熱源用于LAMP擴增30min后，陽性樣本的磷酸根離子顯色結果都為藍色;利用保溫性能最優(yōu)的保溫杯（將初始溫度為63℃的水35min內保持在58℃以上）作為LAMP反應的熱源用于轉基因作物樣本檢測，其結果與實時熒光PCR一致，且整個操作過程30min內即可完成。綜上，使用0.5M NaOH對植物細胞進行裂解，在不經過核酸純化的前提下，利用保溫杯作為LAMP反應的熱源，結合磷酸根離子顯色法，即能實現(xiàn)轉基因作物的田間快速檢測。

6、該方法具有操作簡單、快速，不需要供電設備參與的優(yōu)點。
　　(3)以合成的單鏈DNA為模板，針對切刻酶恒溫擴增(NEAA)容易產生嚴重的非特異性擴增的問題，對NEAA反應體系的溫度、切刻酶活性、Mg2+濃度等因素進行了優(yōu)化;并以轉基因大豆GTS40-3-2為檢測對象，以基因組DNA上臨近切刻酶作用位點的序列作為待測目標，利用不對稱擴增方法生成單鏈目標產物，通過擴增后添加抗原標記的探針對單鏈產物進行捕獲，并采用免疫橫向流動試紙條(LF

7、D)對擴增產物進行檢測，建立了一種高度特異的NEAA產物檢測的方法;并開發(fā)了一種可拋棄式的卡盒，能夠將核酸擴增與LFD檢測過程全都整合在卡盒內，擴增結束后在不需要開蓋操作的條件下即可對擴增產物進行檢測，有效避免擴增產物的氣溶膠污染。該方法具有儀器簡單、反應快速、靈敏度商、特異性強、對抑制劑耐受性強的優(yōu)點，在現(xiàn)場檢測領域具有很大的應用前景。
　　(4)針對熒光染料法對PCR產物進行可視化檢測具有很高背景信號的問題，引入了納米材料消除

8、陰性樣本的背景信號，結果表明:氧化石墨烯(GO)、還原型氧化石墨烯(rGO)、二硫化鉬(MoS2)和二硫化鎢(WS2)這四種材料能夠消除利用SYBR GreenⅠ(SG)染料進行PCR檢測時的背景信號，從而增強檢測的信噪比;納米材料消除PCR背景信號的主要原因是吸附SG和引物;此外，利用納米材料能夠消除由于聚合酶過量而引起的非特異性擴增;以轉基因大豆GTS40-3-2梯度稀釋的DNA作為樣本，利用所述方法進行檢測，其靈敏度與實時熒光PC