用于動(dòng)物性食品中萊克多巴胺快速檢測的SPR技術(shù)研究.pdf

1、萊克多巴胺是一種雙苯烷胺類β-腎上腺素受體興奮劑。與其他β-興奮劑一樣,當(dāng)萊克多巴胺的用量超過臨床用量的4-9倍時(shí),具有良好的營養(yǎng)重分配和生長促進(jìn)作用。但其在動(dòng)物體內(nèi)的殘留一旦通過食物鏈進(jìn)入人體,會(huì)對食用者的安全產(chǎn)生極大的危害。目前,我國已經(jīng)禁止將β-興奮劑作為動(dòng)物營養(yǎng)生長促進(jìn)劑使用。但長久以來,各種因非法使用β-興奮劑造成的中毒事件時(shí)有發(fā)生。隨著國家對瘦肉精(鹽酸克倫特羅)打擊力度的加大,萊克多巴胺作為其替代品越來越多的被非法添加。中

2、國現(xiàn)有的確證檢測方法為中華人民共和國出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《進(jìn)出口動(dòng)物源食品中克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林殘留量的檢測方法液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》SN/T1924-2007。篩選方法為常規(guī)酶聯(lián)免疫法吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)。色譜法檢測前處理麻煩,耗時(shí)且儀器操作復(fù)雜,無法實(shí)現(xiàn)樣品的高通量檢測。常規(guī)酶聯(lián)免疫吸附法,檢測時(shí)間較長,每次分析需要至少3個(gè)小時(shí),而且需要標(biāo)

3、記二抗,底物和濃硫酸對人體有害。因此,建立快速、靈敏、有效、安全的萊克多巴胺殘留檢測方法具有重要意義。
　　 隨著生物技術(shù)的發(fā)展,誕生了生物傳感器技術(shù),生物傳感器(Biosensor)是一種對生物物質(zhì)敏感并將濃度轉(zhuǎn)換為電信號進(jìn)行檢測的儀器。是以固定化的生物敏感材料作為識別元件(包括酶、抗原、抗體、微生物、細(xì)胞、組織、核酸等生物活性物質(zhì)),以氧電極、光敏管、場效應(yīng)管、壓電晶體等作為理化換能器,外加信號放大裝置共同構(gòu)成的分析工具。表

4、面等離子共振(SPR)免疫傳感器作為生物傳感器的一種,是以抗體為識別元件,利用光敏管作為換能器的光學(xué)傳感器。與常規(guī)ELISA相比,具有很多優(yōu)點(diǎn)。首先,樣品無需標(biāo)記,可保持樣品的生物活性與簡化操作；其次,SPR自動(dòng)化程度高,是一種實(shí)時(shí)監(jiān)測工具,可以對生物分子相互作用的全過程進(jìn)行動(dòng)態(tài)檢測和分析。另外,SPR檢測的樣品用量少,抗原抗體的用量大約為常規(guī)EIJSA的1/100-1/10。且可對樣品進(jìn)行回收處理。SPR檢測樣品的時(shí)間短,可實(shí)現(xiàn)高通量

5、的篩選。另外,SPR和常規(guī)ELISA類似,對大部分樣品的檢測也都無需進(jìn)行前處理。因此,SPR被用于小分子殘留物的檢測和生物分子的相互作用的動(dòng)力學(xué)分析。
　　 進(jìn)行免疫分析的關(guān)鍵步驟之一,是合成免疫抗原獲得高效價(jià)和高特異性的抗體。本研究合成了萊克多巴胺的人工全抗原,通過免疫兔子獲得了多克隆抗體。
　　 采用多元酸酐與混合酸酐法合成了萊克多巴胺的人工抗原。通過紫外掃描法、紅外掃描法和SDS-PAGE凝膠電泳對人工抗原進(jìn)行了鑒

6、定,證實(shí)了人工抗原合成成功。
　　 用合成的人工抗原作為免疫原采用背部皮下五點(diǎn)注射法免疫家養(yǎng)大白兔。以與合成免疫原相同的方法合成了包被原,對抗血清進(jìn)行檢測,免疫七次后,獲得了效價(jià)為1:200000的萊克多巴胺多克隆抗血清。與硫酸慶大霉素、沙丁胺醇及克倫特羅等類似物的交叉反應(yīng)率均小于0.01％,對萊克多巴胺的檢出限為0.400ng/mL,抗體具有較高的特異性。
　　 利用SPR對萊克多巴胺多克隆抗體與萊克多巴胺的結(jié)合反應(yīng)進(jìn)

7、行了動(dòng)力學(xué)分析,得到其親和常數(shù)為4.48275E-7M,具有較高的親和力。
　　 以自組裝單層膜法修飾芯片,將RAC-OVA.偶聯(lián)物固定在芯片上,優(yōu)化得到固定化條件為10mmol/LpH4.5醋酸-醋酸鈉緩沖溶液為耦合緩沖液,全抗原濃度為10μg/ml,EDC/NHS活化時(shí)間為7min,全抗原的反應(yīng)時(shí)間為20min下,固定化具有良好的重現(xiàn)性。
　　 以萊克多巴胺的抗體為識別元件,采用間接競爭法,將抗體與不同濃度的萊克多巴