萊克多巴胺新型免疫熒光猝滅檢測技術(shù)研究.pdf

1、目的:以萊克多巴胺(Rac)為檢測對象,建立高靈敏正讀的熒光猝滅試紙條技術(shù)。
　　方法:將抗 Rac單克隆抗體標(biāo)記在金納米顆粒(Gold nanoparticles,Au-NPs)上,制備金標(biāo)抗體猝滅劑(mAb-gold quencher),然后噴涂于結(jié)合墊上。將熒光顆粒直接以 BSA封閉,并與Rac完全抗原按比例混合后,噴涂于硝酸纖維素膜(Nitrocellulose membrane,NC膜)檢測線(Test line,T-l

2、ine)處。封閉后的熒光顆粒噴涂于 NC膜上校準(zhǔn)線(Calibration line,C-line)處作為對照。試紙條經(jīng)一系列的條件優(yōu)化后用以檢測Rac添標(biāo)磷酸鹽緩沖液(PB)、豬尿、豬肉樣品,通過熒光攝像儀和Image J圖像處理軟件獲得定量的檢測數(shù)據(jù)。同時,本研究對建立的Rac熒光淬滅試紙條的特異性、穩(wěn)定性、回收率進(jìn)行了評價。
　　為了建立簡便的液相免疫熒光檢測系統(tǒng),本研究將Rac抗原標(biāo)記到多種不同的熒光納米顆粒上,將Rac抗

3、體標(biāo)記到納米金顆粒上用作金標(biāo)抗體猝滅劑,根據(jù)一定比例以不同的添加方法添加到96孔黑底熒光酶標(biāo)板中,嘗試建立隨著Rac競爭物濃度的變化而導(dǎo)致的熒光猝滅效率變化的響應(yīng)系統(tǒng)。同時對試劑添加順序,標(biāo)記用熒光顆粒,標(biāo)記對象進(jìn)行了研究,以求得到適合用于免疫學(xué)檢測的液相免疫熒光檢測體系。
　　結(jié)果:初步建立了高靈敏正讀的Rac免疫熒光淬滅試紙條,該試紙條上T線上的熒光信號強度和樣品的Rac濃度呈正相關(guān)。試紙條的靈敏度為0.16 ng/mL,檢測

4、范圍為0.16 ng/mL-20 ng/mL。以該熒光淬滅試紙條檢測加標(biāo)于豬尿、豬肉中到的Rac,批內(nèi)重現(xiàn)性實驗結(jié)果顯示,該方法回收率在97.2％-106.1%之間,最大相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.84%。對于批間重現(xiàn)性實驗,回收率在89.0–109.1%之間,最大相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.34%。該試紙條對其他相關(guān)競爭物沒有交叉反應(yīng),具有較強的特異性。該試紙條在室溫保存3個月后仍有很良好的穩(wěn)定性。
　　基于液相熒光能量猝滅體系的免疫學(xué)檢測技術(shù)的研