ISET聯(lián)合細(xì)胞免疫熒光檢測循環(huán)腫瘤細(xì)胞技術(shù)體系的建立及其臨床研究.pdf

1、背景：
　　外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTCs）存在于多種惡性腫瘤中，其檢測對于腫瘤早期診斷、預(yù)后分析、療效檢測以及個(gè)體化治療等眾多方面具有重要的臨床意義，并因能夠?qū)崟r(shí)檢測、創(chuàng)傷小等優(yōu)點(diǎn)成為備受關(guān)注的“液態(tài)活檢”。
　　目前CTCs檢測的主要方法包括依賴腫瘤相關(guān)標(biāo)志物檢測的CellSearch系統(tǒng)及基于形態(tài)學(xué)富集的膜過濾技術(shù)（Isolating by size of epitheli

2、al tumor cells，ISET）。前者是基于細(xì)胞表面表達(dá)不同抗原標(biāo)志，將針對腫瘤細(xì)胞表面抗原的特異性抗體EpCAM、CK等包被于磁珠表面以完成腫瘤細(xì)胞的特異性識(shí)別，借助外加磁場篩選富集CTCs。該技術(shù)的優(yōu)勢在于特異度較高，已有商品化的半自動(dòng)檢測設(shè)備；但腫瘤特異性抗原表達(dá)的缺失會(huì)造成假陰性結(jié)果。后者是根據(jù)細(xì)胞大小的差異，利用過濾的方法將體積較大的腫瘤細(xì)胞篩選富集。該技術(shù)的優(yōu)勢在于方法簡單、價(jià)格低廉，分離獲得的CTCs具有活性可用于

3、后續(xù)研究；但由于缺乏形態(tài)學(xué)診斷金標(biāo)準(zhǔn)，該富集技術(shù)特異性相對較差。
　　我們課題組基于ISET原理，通過前期研究建立了改良ISET檢測CTCs技術(shù)體系，主要工作基礎(chǔ)包括：建立了改良ISET手工實(shí)驗(yàn)裝置、改良了染色方法、提高了腫瘤細(xì)胞截留率，研究結(jié)果表明該技術(shù)體系檢測效果較為理想，腫瘤細(xì)胞截留率可達(dá)80％以上，染色后的細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)可辨，能區(qū)分典型的CTCs與正常白細(xì)胞。但該技術(shù)體系仍然存在不足，首先是形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的缺乏致使CTCs的鑒

4、定易受人為主觀因素影響，其次是過濾過程中時(shí)有堵孔現(xiàn)象出現(xiàn)，致血樣過濾緩慢或不順暢。
　　目的：
　　通過對前期建立的改良ISET檢測循環(huán)腫瘤細(xì)胞技術(shù)體系進(jìn)行優(yōu)化，聯(lián)合細(xì)胞免疫熒光技術(shù)，建立一種新的檢測循環(huán)腫瘤細(xì)胞的可靠方法；通過與CTC-Bi opsy、CellSearch兩種方法對比，驗(yàn)證ISET聯(lián)合細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測多種晚期腫瘤患者外周血中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測效果，探討其臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　方法：
　　1.

5、對課題組前期建立的改良ISET檢測循環(huán)腫瘤細(xì)胞技術(shù)體系進(jìn)行兩處優(yōu)化，即血樣預(yù)處理過程增加?紅細(xì)胞裂解?操作過程、增大濾膜孔徑。
　　2.聯(lián)合細(xì)胞免疫熒光技術(shù)，建立ISET聯(lián)合細(xì)胞免疫熒光檢測循環(huán)腫瘤細(xì)胞技術(shù)體系，并通過檢測23例III/IV期腫瘤患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行臨床預(yù)研究。
　　3.建立ISET聯(lián)合細(xì)胞蠟塊免疫組化技術(shù)體系，以上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志物Twist、Vimentin、E-Cadherin為檢測指標(biāo)驗(yàn)證上述23

6、例臨床樣本中是否存在EMT現(xiàn)象。
　　4.運(yùn)用ISET聯(lián)合細(xì)胞免疫熒光技術(shù)體系檢測肺癌、食管癌、胃癌、結(jié)直腸癌、腎癌、肝癌共計(jì)74例患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞，通過與CTC-Biopsy、CellSearch兩種方法對比，探討其臨床應(yīng)用可行性。
　　結(jié)果：
　　1.對課題組前期建立的改良 ISET檢測循環(huán)腫瘤細(xì)胞技術(shù)體系進(jìn)行兩處優(yōu)化后，新技術(shù)體系過濾更順暢，染色更清晰可辨，腫瘤細(xì)胞截留率無明顯減低。
　　2.通過聯(lián)合

7、細(xì)胞免疫熒光技術(shù)，建立了ISET聯(lián)合細(xì)胞免疫熒光檢測循環(huán)腫瘤細(xì)胞技術(shù)體系。對23例III-IV期腫瘤患者進(jìn)行外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測，發(fā)現(xiàn)CTCs陽性9例（9/23，39.1%），EMT-CTCs陽性3例（3/23，13.0%），CTM3例（3/23，13.0%）。
　　3.建立了ISET聯(lián)合細(xì)胞蠟塊免疫組化技術(shù)體系，對上述23例臨床樣本中檢測到的EMT進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)Twist抗原表達(dá)陽性1例，Vimentin抗原表達(dá)陽性2例。

8、r>　　4.通過檢測74例肺癌、食管癌、胃癌、結(jié)直腸癌、腎癌、肝癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)ISET聯(lián)合細(xì)胞免疫熒光技術(shù)總體陽性檢出率（13/74,17.6%）介于CellSearch（9/74，12.2%）與CTC-Biopsy（14/74,18.9%）之間。進(jìn)一步對比分析，ISET聯(lián)合細(xì)胞免疫熒光方法與CellSearch方法CTCs總體陽性檢出率有顯著性差異（χ2=10.21，p=0.007）,前者檢出率高于后者。ISET聯(lián)合細(xì)

9、胞免www.pdfjm.cnz疫熒光方法與CTC-Biopsy方法CTCs總體陽性檢出率無顯著性差異（χ2=3.926， p=0.062），但兩者一致性較差（Kappa=0.230）。
　　結(jié)論：
　　1.通過對課題組前期ISET技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化，聯(lián)合細(xì)胞免疫熒光技術(shù)，建立了ISET-ICC檢測CTCs技術(shù)體系。
　　2.通過細(xì)胞蠟塊-免疫組化技術(shù)體系，驗(yàn)證了ISET-ICC技術(shù)體系分離獲得的CTCs性質(zhì)，證實(shí)了EMT的存

10、在。
　　3.通過與CellSearch、CTC-Biopsy兩種CTCs檢測方法對比，證實(shí)了ISET-ICC技術(shù)具有臨床應(yīng)用可行性，能夠用于肺癌、食管癌、胃癌、結(jié)直腸癌、腎癌、肝癌患者的CTCs檢測。
　　4.ISET聯(lián)合細(xì)胞免疫熒光技術(shù)能檢測到上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的循環(huán)腫瘤細(xì)胞以及循環(huán)腫瘤微栓，而這兩種細(xì)胞是造成CellSearch假陰性的主要原因。
　　5.ISET聯(lián)合細(xì)胞免疫熒光技術(shù)能夠輔助鑒定CTC-Biopsy方法