用于檢測(cè)小鼠卵母細(xì)胞及早期胚胎中轉(zhuǎn)錄因子的免疫熒光法研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)旨在探索有效的染色前固定和滲透卵母細(xì)胞及早期胚胎的方法，以提高小鼠卵母細(xì)胞和早期胚胎免疫熒光染色的效果；同時(shí)檢測(cè)RNA聚合酶II(PolII)在小鼠卵母細(xì)胞和早期胚胎的表達(dá)，探討PolII在卵母細(xì)胞和早期胚胎發(fā)育中的作用。為大規(guī)模地精確檢測(cè)小鼠卵母細(xì)胞和胚胎中的蛋白質(zhì)與轉(zhuǎn)錄因子打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。 以小鼠卵母細(xì)胞和早期胚胎為試驗(yàn)材料，采用4種不同的固定及滲透方法處理。方案A：先用4％多聚甲醛(PFA)固定1h，再用0.5％Tri

2、tonX-100穿透10min；方案B：先用0.5％TritonX-100穿透10min，再用4％PFA固定1h；方案C：用1％PFA+0.2％TritonX-100同時(shí)固定與穿透1h；方案D：用-20℃預(yù)冷甲醇固定15min，再用0.5％TritonX-100孵育10rain。分析10種轉(zhuǎn)錄因子(TFIIA、TFIIB、TAF1、TAF4、PolII、BRF1、MeCP2、MBD2ab、HP1α及HP1β)在小鼠卵母細(xì)胞中的免疫熒光染

3、色效果。結(jié)果表明，C方案能夠完全檢測(cè)并標(biāo)記出10種轉(zhuǎn)錄因子的熒光信號(hào)，其它3種方案都只能檢測(cè)出部分轉(zhuǎn)錄因子的熒光信號(hào)；對(duì)熒光信號(hào)精細(xì)分布模式與動(dòng)態(tài)變化最典型的TFIIB進(jìn)行仔細(xì)分析，表明經(jīng)C方案處理后10種轉(zhuǎn)錄因子抗體標(biāo)記信號(hào)的分布模式很精細(xì)，熒光信號(hào)的分布清晰，能觀察到信號(hào)隨細(xì)胞核成熟而發(fā)生的動(dòng)態(tài)變化，卵母細(xì)胞的形態(tài)完好；其它3種方案處理后卵母細(xì)胞中雖然能夠觀察到核仁，也能觀察到信號(hào)基本均勻地分布于核區(qū)，但不能清楚地顯示熒光信號(hào)在核仁

4、內(nèi)是否有分布及信號(hào)的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，熒光染色效果不理想。 在光鏡下觀察4種方案處理后的卵母細(xì)胞，著重比較GV期、MI期、MII期的卵母細(xì)胞和2-細(xì)胞期胚胎形態(tài)，C方案處理后的卵母細(xì)胞形態(tài)保存較好，GV期細(xì)胞核和核仁結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞質(zhì)均勻分布，形態(tài)飽滿；MI期透明帶緊實(shí)清晰，厚薄均勻，胞質(zhì)的顆粒狀突起明顯；MII期第一極體結(jié)構(gòu)和2.細(xì)胞期的極體結(jié)構(gòu)都保存完好。其它3種方案處理后卵母細(xì)胞的形態(tài)變形，各發(fā)育時(shí)期的核仁、透明帶、極體等結(jié)構(gòu)受