水牛卵母細(xì)胞和早期胚胎端粒酶活性的初步研究.pdf

1、端粒位于真核染色體末端，是穩(wěn)定染色體末端的重要元件。端粒酶(TER)是一種特殊的細(xì)胞核糖核蛋白(RNP)反轉(zhuǎn)錄酶(RT)，其核心酶包括蛋白亞基和RNA組件。在DNA復(fù)制過程中丟失的端?？梢员欢肆Ｃ感迯?fù)。因此，端粒酶在維持細(xì)胞遺傳結(jié)構(gòu)完整性的過程中有重要作用，研究端粒酶在動物發(fā)生過程中的活性變化將有助于加深對動物胚胎發(fā)生機(jī)理的認(rèn)識。為此，本研究對水牛卵母細(xì)胞、精子、顆粒細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和各階段早期胚胎的端粒酶活性進(jìn)行了測定，以便深入了解水

2、牛早期胚胎發(fā)生和體細(xì)胞克隆的機(jī)理。 1．為建立一套適合水牛各細(xì)胞系和胚胎端粒酶活性檢測及定量的方法，采用Telomerase TRAPeze Detection Kit結(jié)合銀染方法對不同稀釋濃度的293-細(xì)胞和不同水牛細(xì)胞(包括卵母細(xì)胞、精子、顆粒細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及胚胎等)的端粒酶活性進(jìn)行測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著293-細(xì)胞抽提物的稀釋所擴(kuò)增的端粒重復(fù)片斷信號逐漸減弱，經(jīng)分析呈線性下降趨勢，表明Telomerase TRAPeze

3、Detection Kit可以用來檢測細(xì)胞的微量端粒酶活性，通過計(jì)算相對端粒酶活性，水牛胚胎端粒酶活性水平相對高，精子和卵母細(xì)胞能夠檢測到端粒酶活性信號，顆粒細(xì)胞和成纖維細(xì)胞顯著降低(P<0.05)。 2．為了解水牛卵母細(xì)胞和胚胎早期發(fā)育過程中端粒酶的活性變化，本研究使用試驗(yàn)一建立的TRAP-銀染法水牛未成熟卵母細(xì)胞，成熟卵母細(xì)胞和2-4細(xì)胞，8～16細(xì)胞，桑椹胚以及囊胚各階段的早期胚胎端粒酶活性進(jìn)行了測定和定量分析。依據(jù)電泳條

4、帶在成像系統(tǒng)下的光密度值，計(jì)算端粒酶的相對活性(RTA)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未成熟卵母細(xì)胞端粒酶活性比成熟卵母細(xì)胞高(P<0.05)，受精和孤雌激活后2～4細(xì)胞和8～16細(xì)胞胚胎端粒酶活性相對較低，桑椹胚端粒酶活性明顯升高(P<0.05)，囊胚階段達(dá)到最高水平。通過對水牛不同發(fā)育階段胚胎細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)及單細(xì)胞相對端粒酶活性的分析比較結(jié)果顯示，卵母細(xì)胞的單細(xì)胞端粒酶活性最高，囊胚階段的最低。單細(xì)胞端粒酶活性從未成熟卵母細(xì)胞到囊胚階段呈逐漸降低的趨勢。