水牛卵母細(xì)胞及卵泡液蛋白質(zhì)組的初步研究.pdf

1、本研究以水牛卵母細(xì)胞和卵泡液為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)雙向電泳、液相色譜和質(zhì)譜技術(shù)分析卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程中以及卵泡在發(fā)育過(guò)程中蛋白質(zhì)表達(dá)的差異性。論文共包括兩部分，第一部分為文獻(xiàn)綜述部分，第二部分為研究部分。
　　 研究一：本試驗(yàn)以水牛卵母細(xì)胞為對(duì)象，通過(guò)采用雙向凝膠電泳的方法來(lái)建立和優(yōu)化水牛卵母細(xì)胞雙向凝膠電泳的條件，并對(duì)比分析卵母細(xì)胞成熟前后蛋白質(zhì)表達(dá)的差異性。結(jié)果顯示：裂解液A(7M尿素，2M硫脲，4% CHAPS和0.5%DTT

2、)提取的總蛋白采用pH4～7、13 cm IPG膠條上能夠清晰得到水牛卵母細(xì)胞雙向電泳圖譜。成熟前后卵母細(xì)胞蛋白雙向電泳圖譜經(jīng)Image Master軟件對(duì)比分析，檢測(cè)出約300個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，并發(fā)現(xiàn)水牛卵母細(xì)胞成熟前后共存在27個(gè)差異蛋白，其中成功鑒定了8個(gè)蛋白質(zhì)，包括HSP60蛋白，HSC71蛋白，MVP蛋白，GEMIN8蛋白等。說(shuō)明雙向電泳技術(shù)可以用于水牛卵母細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育成熟分子機(jī)理的研究。成功鑒定的這些在成熟后表達(dá)上調(diào)的差異蛋白質(zhì)可

3、以作為水牛卵母細(xì)胞發(fā)育成熟的潛在標(biāo)記物。
　　 研究二：本試驗(yàn)是以水牛卵泡液為研究對(duì)象，通過(guò)采用雙向凝膠電泳的方法來(lái)建立和優(yōu)化水牛卵泡液雙向凝膠電泳的條件，為以后研究卵泡液發(fā)育過(guò)程中蛋白質(zhì)的變化奠定基礎(chǔ)。結(jié)果顯示：TCA/丙酮沉淀法處理得到的總蛋白，當(dāng)采用24 cm、pH3～10非線性(Nonlinear，NL)膠條及上樣量為150μg時(shí)，可獲得較好的卵泡液總蛋白質(zhì)2-DE圖譜；運(yùn)用Image Master2D platinum

4、分析軟件檢測(cè)出約300個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)。
　　 研究三：以水牛卵泡液為試驗(yàn)材料比較不同直徑水牛卵泡液(直徑<4mm、直徑4～8mm、直徑>8mm)的蛋白質(zhì)和多肽表達(dá)變化。試驗(yàn)一：采用基質(zhì)輔助激光解離串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF/TOF MS)建立水牛卵泡液的多肽表達(dá)模型。結(jié)果表明：三種形態(tài)的卵泡液存在12個(gè)顯著差異多肽，其中在大卵泡內(nèi)上調(diào)6個(gè)，下調(diào)有2個(gè)。其中分子量1746Da的多肽在大卵泡中特異性表達(dá)，可作為卵泡成熟的潛在生

5、物標(biāo)志物之一。試驗(yàn)二：采用液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)分離鑒定技術(shù)，經(jīng)過(guò)液相色譜分離并收集顯著差異的餾分，還原烷基化處理后酶解成肽段，再經(jīng)反相色譜二次分離后質(zhì)譜鑒定。結(jié)果表明，在大卵泡中存在顯著高表達(dá)的蛋白質(zhì)峰，質(zhì)譜鑒定結(jié)果為轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin，TRF)。該蛋白質(zhì)的高表達(dá)可作為潛在排卵的標(biāo)志物之一。同時(shí)，本研究采用的LC-MS技術(shù)將為卵泡液大規(guī)模蛋白質(zhì)組分離和表達(dá)譜構(gòu)建打下實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 綜上所述，本研究建立了水