水牛體外成熟卵母細(xì)胞iTRAQ定量蛋白質(zhì)組及其質(zhì)量控制方法的研究.pdf

1、作為一種高度特化的雌性生殖細(xì)胞，哺乳類動物卵母細(xì)胞是動物個體發(fā)生的主體細(xì)胞。大量研究表明，卵母細(xì)胞的成熟質(zhì)量與其受精后胚胎發(fā)育能力直接相關(guān)，同時體外成熟的卵母細(xì)胞是體外受精、體外胚胎生產(chǎn)、胚胎移植等一系列胚胎生產(chǎn)技術(shù)研究的基礎(chǔ)。然而，與體內(nèi)成熟相比，目前大家畜卵母細(xì)胞體外成熟效率、囊胚發(fā)育率、母體受孕率均較低。這與卵母細(xì)胞核質(zhì)成熟不同步、細(xì)胞質(zhì)成熟不充分、體外成熟體系不完善有關(guān)，同時有關(guān)大家畜卵母細(xì)胞成熟分子機制尚不完全清楚也是關(guān)鍵因素

2、之一。卵子在生長和成熟過程中逐步獲得成熟、受精和胚胎發(fā)育的能力，這些能力的獲得與蛋白質(zhì)合成、修飾、降解和聚積密切相關(guān)。因此，應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究卵母細(xì)胞成熟過程中蛋白質(zhì)合成代謝變化規(guī)律將有望進(jìn)一步揭示卵母細(xì)胞成熟的分子機制，對提高卵母細(xì)胞體外成熟質(zhì)量具有重要意義。
　　本研究以具有地方特色的廣西本地水牛為對象，應(yīng)用iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對體外成熟前后、胞質(zhì)正常與異常的水牛卵母細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究。構(gòu)建成熟前、后水牛卵母細(xì)

3、胞蛋白質(zhì)組表達(dá)譜，鑒定體外成熟前后卵母細(xì)胞表達(dá)差異蛋白。通過生物學(xué)信息學(xué)分析，研究差異蛋白在水牛卵子成熟過程中的功能及參與的生物學(xué)途徑，以確定與水牛卵母細(xì)胞成熟相關(guān)的重要蛋白，并揭示水牛卵母細(xì)胞體外成熟的分子機制。
　　首先，應(yīng)用一維凝膠電泳結(jié)合LC-MS/MS技術(shù)構(gòu)建成熟前、后水牛卵母細(xì)胞蛋白質(zhì)組表達(dá)譜。分別從體外成熟前、后的水牛卵母細(xì)胞中鑒定到647和570(FDR＜1％)種蛋白質(zhì)，其中相同鑒定蛋白414種，占總鑒定蛋白的51

4、.6％。成熟前后的水牛卵子中均有9種高豐度表達(dá)蛋白質(zhì)，其中8種為相同鑒定蛋白，包括穹窿體蛋白、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶M3、醛糖還原酶、過氧化物還原酶2、二磷酸核苷酸激酶B、動力蛋白輕鏈1、蛋白精氨酸脫亞氨酶6、類甘油醛-3-三磷酸脫氫酶同源物2。對成熟前、后卵母細(xì)胞相同、特有鑒定蛋白的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，相同鑒定蛋白在包括丙酮酸鹽代謝、糖酵解/糖原生成、TCA循環(huán)、結(jié)氨酸，亮氨酸和異亮氨酸的降解、丙酸代謝、脂肪酸代謝和磷酸戊糖途徑等23條K

5、EGG信號通路顯著相關(guān)(p＜0.05)。表明能量代謝途徑在水牛卵母細(xì)胞成熟過程中發(fā)揮重要作用，它們?yōu)槁涯讣?xì)胞的成熟提供能量來源、保證卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的完成。成熟前卵子特有鑒定蛋白與氧化磷酸化、核糖體、蛋白酶體等信號通路顯著相關(guān)(p＜0.05);成熟后卵子特有鑒定蛋白與DNA復(fù)制、氨基糖和核苷酸糖代謝信號通路顯著相關(guān)(p＜0.05)。結(jié)果還同時表明一些蛋白貫穿整個卵子成熟過程，并發(fā)揮重要作用。此外，卵母細(xì)胞在不同的發(fā)育時期特異表達(dá)一些蛋白

6、，參與維持其必需的生長和發(fā)育。
　　其次，應(yīng)用iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對成熟前、后和胞質(zhì)正常與異常的水牛卵母細(xì)胞進(jìn)行了研究。從成熟前后及胞質(zhì)正常與異常的水牛卵母細(xì)胞共鑒定到3857(FDR＜1％)種蛋白質(zhì)，可定量蛋白數(shù)3245種。進(jìn)一步分析顯示，兩肽段以上鑒定蛋白數(shù)達(dá)到3287種，占總鑒定蛋白的85％。與已報道的牛卵母細(xì)胞蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)集（占總鑒定量的34％-88％）相近。胞質(zhì)正常MⅡ期卵子和GⅤ期卵子比較篩選出173種差異表達(dá)

7、蛋白，其中上調(diào)表達(dá)108種，下調(diào)表達(dá)65種。胞質(zhì)正常與胞質(zhì)異常的MⅡ期水牛卵子比較篩選出146種差異表達(dá)蛋白，其中111種上調(diào)表達(dá)，35種下調(diào)表達(dá)。胞質(zhì)正常MⅡ期卵子和GⅤ期卵子的差異表達(dá)蛋白GO分析顯示，上調(diào)蛋白主要參與基于微管過程、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運、能量產(chǎn)生和物質(zhì)代謝及細(xì)胞周期等生物學(xué)進(jìn)程。胞質(zhì)正常MⅡ期卵子與胞質(zhì)異常MⅡ期卵子比較的差異表達(dá)蛋白GO分析顯示，上調(diào)蛋白主要參與氧化還原、翻譯、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運、氧化磷酸化及小G蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等生

8、物學(xué)進(jìn)程。相較于GⅤ期細(xì)胞和胞質(zhì)異常MⅡ期卵母細(xì)胞，氧化磷酸化信號通路中參與電子轉(zhuǎn)運呼吸鏈的關(guān)鍵酶在胞質(zhì)正常MⅡ期細(xì)胞中表達(dá)均顯著上調(diào)。表明氧化磷酸化水平顯著影響水牛卵子的成熟質(zhì)量，是卵子減數(shù)分裂和發(fā)育能力的重要過程;表明卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟過程需要大量的能量供給，提示MⅡ期卵母細(xì)胞在為隨后的受精過程所需的能量代謝做充分的準(zhǔn)備。
　　在上述研究過程中發(fā)現(xiàn)，樣品中小分子量、低豐度蛋白在進(jìn)行質(zhì)譜鑒定時，產(chǎn)生可測序肽段的數(shù)量少，其信號極

9、易受高豐度蛋白信號的抑制和掩蓋，致使小分子量、低豐度蛋白無法被鑒定出來，而這些小分子量、低豐度蛋白又具有極其重要的生理功能。為此，研究發(fā)展了一種能有效分離、富集小分子量、低豐度蛋白質(zhì)和去除高豐度蛋白的“Gel-filter”的凝膠分離方法。結(jié)果顯示，隨著血清樣品上樣量的增加，小分子量蛋白條帶逐漸加深，表明隨著蛋白量的增加，富集效果明顯。經(jīng)過該方法處理的樣品，蛋白質(zhì)相對豐度不發(fā)生改變。將該方法與文獻(xiàn)報道的其他三種常用分離方法進(jìn)行了比較，并

10、利用質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行鑒定分析。結(jié)果顯示，Gel-filter方法共鑒定到559(FDR＜1％)種血清小分子量蛋白質(zhì)，為四種方法中鑒定數(shù)最高。對鑒定的小分子量蛋白、肽段進(jìn)行分子量分布分析顯示，在各分子量區(qū)間，Gel-filter方法的鑒定數(shù)為四種方法中最高。以譜圖數(shù)表示蛋白的豐度并進(jìn)行歸一化后對四種方法共同鑒定的小分子量蛋白豐度分布進(jìn)行分析，Gel-filter方法富集的小分子量蛋白豐度分布范圍相對較寬。通過Gel-filter方法富集到的小

11、分子量蛋白可獲得更高的蛋白序列覆蓋度。為進(jìn)一步評估不同方法小分子量蛋白的回收效率，通過在血清樣品中加入大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)的輕穩(wěn)定同位素標(biāo)記的GST蛋白(26kDa)后，分別經(jīng)不同方法處理。質(zhì)譜鑒定分析顯示，Gel-filter方法處理GST蛋白的回收效率為33.1±0.01％，顯著高于Differential solubilization(DS)和ProteoMiner試劑盒方法，后兩種方法處理GST蛋白的回收效率分別為18.7±0.01