蛋白質(zhì)組肽段鑒定質(zhì)量控制方法的研究與應(yīng)用.pdf

1、隨著人類基因組測(cè)序的完成，為從整體上掌握生命現(xiàn)象的本質(zhì)和規(guī)律，生命科學(xué)對(duì)生命活動(dòng)功能的真正執(zhí)行者--蛋白質(zhì)展開了全面研究，蛋白質(zhì)組學(xué)成為后基因組時(shí)代生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。生物質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展為蛋白質(zhì)組研究提供了高通量、高靈敏度和高分辨率的分析平臺(tái)，成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的支撐技術(shù)之一，并直接促成了大規(guī)模蛋白質(zhì)組研究的開展。而串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)搜索策略鑒定蛋白質(zhì)，可以滿足組學(xué)研究高通量、自動(dòng)化的要求，已成為人類蛋白質(zhì)組表達(dá)譜研究的重要技術(shù)

2、路線。
　　 數(shù)據(jù)庫(kù)搜索策略極大地增強(qiáng)了生物質(zhì)譜數(shù)據(jù)的解析效率，但由于生物樣品的多樣性和實(shí)驗(yàn)過(guò)程的復(fù)雜性，以及現(xiàn)有搜索算法的局限性，使其不能完全解決蛋白質(zhì)鑒定問(wèn)題，導(dǎo)致質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析一直是蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)處理的難點(diǎn)。數(shù)據(jù)庫(kù)搜索策略存在的問(wèn)題主要可以概括為兩點(diǎn)：即如何保證鑒定結(jié)果的完整性和正確性。
　　 本研究致力于解決質(zhì)譜數(shù)據(jù)蛋白質(zhì)鑒定的正確性問(wèn)題，針對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索策略鑒定肽段結(jié)果的質(zhì)量控制展開，在保證肽段置信度的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)有

3、效地區(qū)分正確/錯(cuò)誤的鑒定結(jié)果。數(shù)據(jù)庫(kù)搜索過(guò)程中主要由于模糊匹配和隨機(jī)匹配兩種情況存在導(dǎo)致陰性結(jié)果的產(chǎn)生，本研究也正是從這兩方面著手。同時(shí)，本研究還著重考慮了質(zhì)譜數(shù)據(jù)質(zhì)量控制研究所面臨的下面幾個(gè)挑戰(zhàn)：
　　 1．質(zhì)譜數(shù)據(jù)復(fù)雜程度高，數(shù)據(jù)庫(kù)搜索結(jié)果易受質(zhì)譜儀器類型、圖譜產(chǎn)生參數(shù)、搜庫(kù)參數(shù)、數(shù)據(jù)庫(kù)大小構(gòu)成等多方面因素影響，充分利用質(zhì)譜數(shù)據(jù)中所包含的信息將有利于全面完整地描述數(shù)據(jù)集特征；
　　 2．如何建立客觀的評(píng)價(jià)體系，既考慮

4、數(shù)據(jù)集整體置信度水平，又能體現(xiàn)肽段的“個(gè)性”，為實(shí)驗(yàn)人員提供單個(gè)肽段/蛋白鑒定結(jié)果的正確概率；
　　 3．保證所發(fā)展模型和方法的通用性及普適性，實(shí)現(xiàn)有效分析、整合多種來(lái)源的海量復(fù)雜數(shù)據(jù)；
　　 4．高精度質(zhì)譜數(shù)據(jù)已成為生物質(zhì)譜技術(shù)發(fā)展的趨勢(shì)，如何針對(duì)高精度質(zhì)譜數(shù)據(jù)的特點(diǎn)解析結(jié)果將成為質(zhì)譜信息學(xué)的發(fā)展方向。
　　 本文針對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索策略鑒定肽段質(zhì)量控制所面臨的上述問(wèn)題，考慮兩種肽段水平產(chǎn)生陰性結(jié)果的原因，基于隨機(jī)數(shù)

5、據(jù)庫(kù)搜索策略，對(duì)不同精度質(zhì)譜儀器數(shù)據(jù)以及SEQUEST和Mascot兩種最常用數(shù)據(jù)庫(kù)搜索引擎的結(jié)果展開質(zhì)控方法研究，提高了肽段過(guò)濾過(guò)程的靈敏度和實(shí)用性，并構(gòu)建了大規(guī)模蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)的質(zhì)控分析流程，為后續(xù)生物學(xué)問(wèn)題研究提供更可信、更完備的肽段和蛋白質(zhì)列表。
　　 首先，利用標(biāo)準(zhǔn)蛋白數(shù)據(jù)集和理論模擬譜圖集獲得常規(guī)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索結(jié)果模糊匹配的基本模式，以及在不同精度數(shù)據(jù)集中的出現(xiàn)頻率，并考察了不同數(shù)據(jù)庫(kù)搜索質(zhì)量誤差設(shè)置對(duì)模糊匹配的影響。同時(shí)

6、，通過(guò)構(gòu)建包含人和非人物種蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)，初步估計(jì)了實(shí)際樣品數(shù)據(jù)集中模糊匹配發(fā)生的概率。我們認(rèn)為模糊匹配主要受到數(shù)據(jù)集母離子精度的影響，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)蛋白數(shù)據(jù)集應(yīng)采用和樣品蛋白同源性小的序列庫(kù)作為搜索數(shù)據(jù)庫(kù)能更真實(shí)的評(píng)估算法性能，而對(duì)于實(shí)際樣品數(shù)據(jù)集可以通過(guò)把無(wú)法區(qū)分的鑒定肽段合并不做取舍，來(lái)提高蛋白質(zhì)裝配的準(zhǔn)確性。
　　 然后，針對(duì)隨機(jī)匹配問(wèn)題，分別對(duì)高精度LTQ-FT質(zhì)譜數(shù)據(jù)、SEQUEST和Mascot軟件的數(shù)據(jù)庫(kù)搜索結(jié)果，通過(guò)

7、發(fā)展新搜庫(kù)策略和過(guò)濾方法有效改進(jìn)了其肽段水平的質(zhì)控性能。
　　 LTQ-FT是一種兼具高精度和高通量的質(zhì)譜平臺(tái)，被廣泛地應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)定性和定量分析中，但是該儀器時(shí)間依賴的系統(tǒng)誤差會(huì)因?yàn)閿?shù)據(jù)庫(kù)搜索時(shí)無(wú)法確定合理的質(zhì)量誤差范圍而使其精度大打折扣。我們?cè)敿?xì)分析了LTQ-FT質(zhì)譜平臺(tái)母離子質(zhì)量誤差分布的特點(diǎn)，改進(jìn)了現(xiàn)有校正公式，并開發(fā)了自動(dòng)化校正的工具。同時(shí)，我們提出了一種全新的數(shù)據(jù)庫(kù)搜索策略--大誤差搜庫(kù)小誤差過(guò)濾，用于數(shù)據(jù)庫(kù)搜索

8、誤差規(guī)范和搜庫(kù)結(jié)果確認(rèn)，通過(guò)在標(biāo)準(zhǔn)蛋白數(shù)據(jù)集和實(shí)際樣品數(shù)據(jù)集上的應(yīng)用，證明了該策略可以顯著提高鑒定肽段過(guò)濾方法的靈敏度。
　　 基于隨機(jī)數(shù)據(jù)庫(kù)策略和非參概率密度模型，我們發(fā)展了一種用于過(guò)濾鳥槍法蛋白質(zhì)組串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)SEQUEST軟件肽段鑒定結(jié)果的方法--貝葉斯非參模型(BNP)。共提取了28個(gè)描述搜庫(kù)結(jié)果及其匹配信息的特征參數(shù)，利用多元線性回歸、期望最大算法和貝葉斯公式完成了肽段局部發(fā)現(xiàn)假陽(yáng)性率的估計(jì)，并給出其過(guò)濾門限。將模型應(yīng)

9、用于三批標(biāo)準(zhǔn)蛋白和五批實(shí)際樣品（包括LCQ、LTQ和LTQ-FT三種儀器的數(shù)據(jù)）串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)集的SEQUEST搜庫(kù)結(jié)果中，并與動(dòng)態(tài)卡值法、PeptideProphet以及簡(jiǎn)單非參模型比較，在給定期望假陽(yáng)性率下，BNP模型能得到最多的過(guò)濾肽段數(shù)，說(shuō)明了該模型較好的靈敏度和普適性，并且根據(jù)BNP模型計(jì)算的概率分值可以保留相當(dāng)一部分被其他方法過(guò)濾的高可信肽段結(jié)果，從而大大提高了質(zhì)譜數(shù)據(jù)的利用效率。
　　 Mascot作為與SEQUES

10、T齊名的另外一種常用的搜庫(kù)軟件，因?yàn)榉N種原因?qū)ζ滂b定肽段的質(zhì)控研究較少，基于Mascot一致性閾值可以嚴(yán)格控制結(jié)果的假陽(yáng)性率，但是其低靈敏度會(huì)帶來(lái)較高的假陰性率，造成大量真實(shí)結(jié)果的丟失。我們對(duì)現(xiàn)有Mascot鑒定結(jié)果的過(guò)濾和評(píng)估方法進(jìn)行了分類總結(jié)，并基于隨機(jī)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索策略，通過(guò)應(yīng)用概率模型整合新特征參數(shù)完善了Mascot肽段水平的質(zhì)量控制，有效提高了Mascot搜庫(kù)結(jié)果質(zhì)控的敏感性，降低了假陰性率并增加了高可信鑒定肽段數(shù)目。
　　

11、 隨著人類蛋白質(zhì)組計(jì)劃研究的迅速發(fā)展，在實(shí)驗(yàn)儀器和技術(shù)不斷進(jìn)步的同時(shí)，也產(chǎn)生了大量的異質(zhì)數(shù)據(jù)。為有效整合多來(lái)源實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，我們基于貝葉斯非參模型構(gòu)建了大規(guī)模質(zhì)譜數(shù)據(jù)統(tǒng)一質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)的分析流程，完成了中國(guó)人類肝臟蛋白質(zhì)組計(jì)劃中小鼠肝臟細(xì)胞器表達(dá)譜數(shù)據(jù)集的系統(tǒng)分析，改進(jìn)了表達(dá)譜常規(guī)分析策略的鑒定結(jié)果。
　　 在蛋白質(zhì)組研究中，應(yīng)用質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)獲得高可信的鑒定結(jié)果對(duì)于后續(xù)的生物學(xué)和臨床學(xué)應(yīng)用意義重大，因此如何有效地控制鑒定肽段的假陽(yáng)性率仍