老齡卵子，端粒酶失活和端粒縮短對小鼠胚胎干細(xì)胞多能性影響的研究.pdf

1、衰老是一個非常復(fù)雜的生物學(xué)過程，器官中細(xì)胞功能的逐漸衰退導(dǎo)致個體最終走向死亡。生物體的衰老由一連串生理的和細(xì)胞內(nèi)部的變化導(dǎo)致的，細(xì)胞老化涉及許多復(fù)雜機制，包括氧化應(yīng)激活性氧(ROS)的氧化損傷、DNA突變、蛋白質(zhì)損傷、端粒功能障礙等。端?？s短和功能異常導(dǎo)致細(xì)胞周期的停滯甚至細(xì)胞死亡，機體發(fā)生衰老時端粒縮短限制了成體干細(xì)胞繼續(xù)發(fā)揮補償和修復(fù)功能。能否從老齡卵子或端粒酶失活的胚胎中高效地分離多能性胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)至今尚未明確。ES細(xì)胞

2、是一種獨特的細(xì)胞，在特定的培養(yǎng)條件下具有無限增殖和自我更新能力，而這些"永葆青春"的ES細(xì)胞如何逃脫衰老的命運并保持自身多能性仍是未解之謎。本研究將利用ES細(xì)胞作為模型，探索衰老卵子、端粒酶活性缺失和端粒縮短對小鼠ES細(xì)胞多能性的影響。 卵子質(zhì)量隨著女性年齡增長而下降，是影響生殖能力的主要因素。卵子中母系遺傳物質(zhì)衰老影響卵子的基因表達以及著床后的胚胎發(fā)育。迄今為止，大多數(shù)用于研究的ES細(xì)胞系來源于年輕的雌性小鼠，能否從生育年齡較

3、大的雌性個體排出的成熟卵子有效地獲得多能性ES細(xì)胞仍有待研究證實。我們通過人工激活小鼠卵子建立具有多潛能的孤雌胚胎干細(xì)胞系(pES)，從而避免精子受精影響對母系物質(zhì)衰老的研究。結(jié)果顯示，10-12月齡的C57小鼠產(chǎn)生卵子的數(shù)量較年輕的小鼠少，這些卵子表達高水平ROS。年輕小鼠和老齡小鼠來源的孤雌胚胎著床前發(fā)育率沒有差異，但通過熒光染色檢查發(fā)現(xiàn)老齡小鼠的孤雌囊胚中內(nèi)細(xì)胞團數(shù)(ICM)更少，凋亡細(xì)胞數(shù)上升，基因組DNA損傷增加，存在顯著性差

4、異；但是年輕小鼠和老齡小鼠的囊胚細(xì)胞端粒長度并無差別，而兩者產(chǎn)生pES細(xì)胞系的效率相似。來源于老齡小鼠卵子的pES細(xì)胞系在最初兩代中產(chǎn)生較少ES樣克隆，但在此后的傳代過程中克隆數(shù)量迅速增長。值得注意的是，與其來源的孤雌囊胚相比，老齡小鼠pES細(xì)胞的DNA損傷減少，且與年輕小鼠的pES細(xì)胞的DNA損傷情況相似。此外，年輕小鼠和老齡小鼠pES細(xì)胞在端粒長度，多能性分子標(biāo)志的表達如Oct4、Nanog、SSEA1和堿性磷酸酶(AP)，畸胎瘤形

5、成等方面沒有差別，嵌合體產(chǎn)生率均較高(約70％)而且每個組織均有ES細(xì)胞的貢獻。這些結(jié)果表明從老齡雌性的卵子能有效分離多能性ES細(xì)胞，通過分離和體外培養(yǎng)的過程可以篩選DNA完整和端粒正常的ES細(xì)胞系。 我們應(yīng)用端粒酶活性失活的小鼠模型研究ES細(xì)胞分離過程中端粒酶失活和端?？s短是否影響ES細(xì)胞的分離效率和ES細(xì)胞的多能性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ES細(xì)胞系的分離效率在WT，G3以及G4 Terc—/—胚胎中沒有差異，KSR ES培養(yǎng)基培養(yǎng)后大約

6、60％的囊胚能分離出ES細(xì)胞系，所有的ES細(xì)胞系表達多能性分子標(biāo)志Oct4，Nanog，SSEA1和AP。四倍體胚胎補償法是檢測ES細(xì)胞多能性的傳統(tǒng)方法，此方法需要融合2-細(xì)胞胚胎，且只能用于某些具有雜交背景的早代ES細(xì)胞系。我們發(fā)現(xiàn)了一種更為簡便和高效的方法來檢測ES細(xì)胞的多能性，該方法通過Piezo注射儀將ES細(xì)胞注射入4-或8-細(xì)胞胚胎，這些胚胎體內(nèi)發(fā)育形成F0具有完全生殖系轉(zhuǎn)移的ES細(xì)胞小鼠或高度嵌合的小鼠，結(jié)果顯示這種方法產(chǎn)生

7、成活轉(zhuǎn)基因小鼠的效率比四倍體囊胚補償法高。無論雜合或WT ES細(xì)胞系均能產(chǎn)生完全生殖系轉(zhuǎn)移的ES細(xì)胞來源的F0小鼠，但是通過這種方法未能獲得來源于端粒酶失活小鼠ES細(xì)胞的F0小鼠。G1 ES細(xì)胞系嵌合體形成率較高(64％)，而G3和G4 ES細(xì)胞系的嵌合體形成率效率較低(分別為6％和9％)，都沒有生殖系轉(zhuǎn)移發(fā)生，結(jié)果顯示端粒酶失活或端?？s短以及功能異常降低ES細(xì)胞在體內(nèi)的發(fā)育和分化能力。 我們的研究結(jié)果表明從老齡卵子和端粒酶活性