發(fā)育微環(huán)境對(duì)卵母細(xì)胞和早期胚胎線粒體的影響.pdf

1、第一部分超促排卵對(duì)卵母細(xì)胞和早期胚胎線粒體的影響
　　 目的：線粒體是供應(yīng)能量、調(diào)節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)的重要細(xì)胞器，也是唯一能遺傳DNA的細(xì)胞器，與卵子和胚胎發(fā)育潛能相關(guān)。在卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中，線粒體發(fā)生數(shù)量、形態(tài)分布和功能的一系列變化。超促排卵使卵巢超越生理調(diào)控同步發(fā)育多個(gè)卵子，其干預(yù)階段正是卵母細(xì)胞胞質(zhì)成熟、線粒體儲(chǔ)備完善的階段。多項(xiàng)研究提示超促排卵可以改變卵巢微環(huán)境，獲得的卵子質(zhì)量下降，因此超促排卵應(yīng)用的安全性值得探討。本項(xiàng)目通過(guò)小鼠

2、模型，對(duì)比超促排卵和非超促排卵卵子體外受精后發(fā)育潛能，同時(shí)檢測(cè)卵子和早期胚胎線粒體的數(shù)目、形態(tài)、功能、線粒體DNA(mitochondrialDNA，mtDNA)的異質(zhì)性以及卵巢組織的氧化損傷和抗氧化能力，以探討超促排卵時(shí)卵巢環(huán)境改變對(duì)卵母細(xì)胞線粒體的影響以及與發(fā)育潛能的關(guān)系。
　　 方法：采用C57BL/6J小鼠，注射孕馬血清促性腺激素和人絨毛膜促性腺激素(humanchorionicgonadotropin，HCG)為超促排

3、卵組，自然動(dòng)情期注射HCG為對(duì)照組。收集兩組所獲得的卵子和體外受精后所獲的胚胎。采用實(shí)時(shí)PCR法檢測(cè)單卵/胚胎mtDNA拷貝數(shù)、熒光素酶法檢測(cè)單卵/胚胎ATP、JC-1染色檢測(cè)線粒體膜電位(Mitochondrialmembranepotential，△Ψm)、MitoTrackerRed染色觀察線粒體分布、電鏡觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)以及用變性高效液相色譜法檢測(cè)mtDNA的異質(zhì)性。對(duì)比兩組間的卵子成熟度、胚胎發(fā)育狀況、線粒體各指標(biāo)的差異以及

4、卵巢組織的氧化損傷產(chǎn)物和總抗氧化能力的差異。
　　 結(jié)果：
　　 1.與對(duì)照組相比，超促排卵組取卵成功率高(P<0.01)，獲卵總數(shù)多(P<0.01)，受精卵多(P<0.01)，卵裂胚胎數(shù)多(P<0.01)，形成囊胚數(shù)多(P<0.01)，但獲得的不成熟卵和低潛能卵子比例高。
　　 2.超促排卵組獲得的MⅡ卵和受精卵的線粒體拷貝數(shù)低于對(duì)照組(P<0.01，P<0.05)，獲得的2細(xì)胞胚胎和囊胚線粒體拷貝數(shù)與對(duì)照組差

5、異無(wú)顯著性。
　　 3.超促排卵組獲得的MⅡ卵和受精卵的ATP含量低于對(duì)照組(P<0.01，P<0.05)，獲得的2細(xì)胞胚胎和囊胚的ATP含量與對(duì)照組差異無(wú)顯著性。
　　 4.超促排卵組獲得的MⅡ卵的△Ψm低于對(duì)照組(P<0.01)，獲得的2細(xì)胞胚胎和囊胚的△Ψm與對(duì)照組差異無(wú)顯著性。
　　 5.電鏡顯示超促排卵組獲得的部分MⅡ卵線粒體稀少，MitoTrackerRed熒光染色顯示超促排卵組MⅡ卵線粒體分布極性聚

6、集比例高于對(duì)照組(P<0.01)。
　　 6.超促排卵組與對(duì)照組均未檢測(cè)到mtDNAD-loop區(qū)的異質(zhì)性。
　　 7.單次超促排卵的卵巢氧化損傷產(chǎn)物與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異，總抗氧化能力高于對(duì)照組(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.超促排卵增加取卵成功率、增加獲卵總數(shù)和高發(fā)育潛能卵子總數(shù)。
　　 2.超促排卵同時(shí)也募集了不成熟卵和線粒體儲(chǔ)備低下的卵子，這些卵子在隨后的受精和胚胎發(fā)育過(guò)程中被

7、淘汰，超促排卵獲得的囊胚其線粒體數(shù)量、功能與對(duì)照組無(wú)顯著差異。
　　 3.單次超促排卵與對(duì)照組相比不顯著增加卵子mtDNAD-loop區(qū)的突變頻率。
　　 第二部分子宮內(nèi)膜異位癥腹腔液對(duì)早期胚胎線粒體的影響
　　 目的：子宮內(nèi)膜異位癥(內(nèi)異)與不孕存在很強(qiáng)的相關(guān)性。輕度盆腔內(nèi)異患者沒(méi)有輸卵管和卵巢的解剖異常但也常伴有不孕。內(nèi)異是炎癥性和免疫性疾病。內(nèi)異腹腔液含有炎癥因子、活性氧和活性氮，能抑制胚胎發(fā)育，但機(jī)制未明

8、。線粒體是胚胎發(fā)育潛能的重要決定因素，對(duì)環(huán)境極其敏感，是炎癥因子和各種自由基作用的靶細(xì)胞器，易受損而誘發(fā)細(xì)胞凋亡。本研究通過(guò)分析輕度內(nèi)異不孕患者助孕治療的臨床資料、其腹腔液一氧化氮(nitricoxide，NO)的含量以及腹腔液對(duì)小鼠胚胎線粒體的影響，來(lái)探討輕度內(nèi)異盆腔微環(huán)境對(duì)早期胚胎的影響，尋求其相關(guān)不孕的最佳處理方式。
　　 方法：對(duì)腹腔鏡探查證實(shí)為輕度內(nèi)異患者進(jìn)行術(shù)后隨訪，與輸卵管性不孕組對(duì)比，分析兩組體外受精-胚胎移植(

9、invitrofertilization-embryotransfer，IVF-ET)治療的臨床特征。同時(shí)收集腹腔液檢測(cè)其NO代謝物的含量，用含不同濃度硝普鈉(sodiumnitroprusside，SNP，是NO的供體)的培養(yǎng)液孵育鼠胚，觀察NO對(duì)早期胚胎發(fā)育的影響。將腹腔液按10％比例摻入培養(yǎng)液進(jìn)行鼠胚培養(yǎng)，計(jì)算鼠胚卵裂率和囊胚形成率，同時(shí)用實(shí)時(shí)PCR法測(cè)定單胚胎mtDNA拷貝數(shù)、熒光素酶法測(cè)定單胚胎ATP、JC-1染色檢測(cè)胚胎線粒

10、體膜電位(Mitochondrialmembranepotential，△Ψm)、電鏡觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)，對(duì)比組間胚胎線粒體各指標(biāo)的差異。
　　 結(jié)果：
　　 1.輕度內(nèi)異患者IVF受精率顯著低于輸卵管性不孕(P<0.05)，而獲卵率、卵裂率、優(yōu)胚率、種植率、妊娠率和流產(chǎn)率兩組之間均無(wú)顯著性差異。
　　 2.內(nèi)異組腹腔液NO顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。含10-6M和10-4MSNP培養(yǎng)液孵育鼠胚的卵裂率和囊胚

11、形成率降低(P<0.01)，而10-8M組卵裂率和囊胚形成率變化不顯著。
　　 3.內(nèi)異組腹腔液孵育鼠胚的卵裂率和囊胚形成率低于非內(nèi)異組和對(duì)照組(P<0.01)。
　　 4.內(nèi)異組腹腔液孵育鼠胚的2細(xì)胞期和4細(xì)胞期胚胎的ATP含量、△Ψm高于非內(nèi)異組和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而組間線粒體拷貝數(shù)差異無(wú)顯著性。
　　 結(jié)論：
　　 1.輕度內(nèi)異患者IVF-ET治療的療效與輸卵管性不孕無(wú)顯著差異。