營養(yǎng)因素對奶牛卵母細胞體外發(fā)育和克隆效率的影響.pdf

1、奶牛體細胞核移植技術在加速品種改良、結合轉基因技術生產珍貴醫(yī)用蛋白等方面有著廣闊的應用前景。但目前克隆效率低、流產率高、后代存活率低和出生后代發(fā)育異常等成為該項技術廣泛應用的瓶頸。導致這一瓶頸的因素很多，其中現(xiàn)有卵母細胞體外培養(yǎng)系統(tǒng)不能使卵母細胞，特別是卵胞質達到成熟和激活方法不能完全激活核移植后的重構胚是兩個重要因素，這兩個因素能引起核移植后核質互作出現(xiàn)異常，導致重構胚不能正確的實現(xiàn)重編程。因此，完善奶牛卵母細胞體外成熟培養(yǎng)系統(tǒng)，優(yōu)化

2、核移植后卵母細胞的激活方法，成為提高核移植效率的兩個關鍵環(huán)節(jié)。
　　 本研究依據(jù)現(xiàn)代細胞營養(yǎng)學理論，形成了一種無血清、化學成分明確的奶牛卵母細胞體外成熟培養(yǎng)液，并優(yōu)化該培養(yǎng)液成熟培養(yǎng)的奶牛卵母細胞的激活條件。以體外培養(yǎng)的奶牛耳部成纖維細胞、輸卵管上皮細胞及卵丘細胞為供體細胞，進行體細胞核移植證實了上述奶牛卵母細胞成熟培養(yǎng)液和激活方法的可行性。同時，研究綠茶多酚對IVF及NT植前胚胎體外發(fā)育的影響及機理，為提高核移植胚胎體外發(fā)育率

3、提供理論依據(jù)。
　　 1.奶牛核移植供體細胞系的建立
　　 采用組織塊貼壁法從奶牛耳部組織分離成纖維細胞，采用機械法分離奶牛輸卵管上皮細胞，利用含血清的DMEM/F12培養(yǎng)液對兩種細胞進行原代和續(xù)代培養(yǎng)：用胰蛋白酶消化液從卵泡中抽取的卵丘-卵母細胞復合物分離卵丘細胞，利用改良的McCoy's5a培養(yǎng)液進行原代和續(xù)代培養(yǎng)。傳代純化后分析三種細胞的形態(tài)特征、體外生長曲線和染色體核型，結果表明，三種細胞的形態(tài)正常、體外生長曲線

4、符合正常細胞的一般規(guī)律、染色體核型正常，均可作為體細胞核移植的供體細胞。
　　 2.無血清、化學成分明確的奶牛卵母細胞體外成熟培養(yǎng)液的優(yōu)化
　　 用PVP-40代替血清，建立了一種化學成分明確的卵母細胞體外成熟基礎培養(yǎng)液(SOFaa-PVP-40)，分別單獨將不同濃度的葡萄糖(0mM、1.5mM、5.6mM和20mM)、IGF-I(0ng/mL、50ng/mL、100ng/mL和150ng/mL)、GTPs(0μM、10

5、μm、15μM和20μM)添加到基礎培養(yǎng)液中，對奶牛卵母細胞進行IVM、IVF和IVC，以篩選三種物質適宜的添加濃度。結果表明，獲得最高卵裂率和囊胚率的葡萄糖、IGF-I和GTPs添加濃度分別為5.6mM，100ng/mL、15μM。將三種物質以優(yōu)化的濃度同時加入到基礎培養(yǎng)液中，構建一種無血清、化學成分明確的優(yōu)化培養(yǎng)液（Optimized SOFaa），以傳統(tǒng)的TCM-199+FBS培養(yǎng)液為對照，比較兩組培養(yǎng)液培養(yǎng)后的卵母細胞體外成熟率

6、、卵裂率、囊胚率及細胞內GSH含量。結果表明，所構建的卵母細胞優(yōu)化培養(yǎng)液可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)的TCM-199+FBS培養(yǎng)液用于奶牛卵母細胞的體外成熟培養(yǎng)，并提高了成熟后卵母細胞的囊胚發(fā)育率(39.2％vs.30.4％，P<0.05)。卵母細胞發(fā)育能力的提高與細胞內GSH含量的增加有關(14.3 pmol/oocyte-vs.8.9pmol/oocyte，P<0.05)。本研究的結果還證實，在秋季利用切剖法對卵巢表面直徑為3～6mm的卵泡采集卵母

7、細胞，可以獲得較好的卵母細胞數(shù)量、體外成熟率、體外受精后卵裂率及囊胚率。
　　 3.奶牛卵母細胞激活條件的優(yōu)化
　　 通過比較不同處理對卵母細胞激活及孤雌胚發(fā)育的影響篩選奶牛卵母細胞的激活方法。奶牛卵母細胞在Optimized SOFaa培養(yǎng)液中成熟并脫去卵丘細胞后按照試驗設計進行激活處理。以單一激活，成熟的卵母細胞用離子霉素(5μM，5min)，乙醇(7％，7min)，鈣離子載體A23187(5μM，5min)或鍶(1

8、0mM，5h)單獨激活試劑進行處理。離子霉素和乙醇處理組獲得的原核形成率(39.4％，41.2％vs.21.3％，25.2％)和卵裂率(30.3％，28.1％vs.19.7％，23.7％)顯著高與另外兩組(P<0.05)。以聯(lián)合激活，用上述濃度的離子霉素和乙醇與6-二甲基氨基嘌呤(2.0mM，3h)或放線茵酮(10μg/mL)+細胞松弛素B(7.5μg/mL，3h)聯(lián)合處理卵母細胞。離子霉素+6-二甲基氨基嘌呤處理組和乙醇+放線菌酮+細

9、胞松弛素B處理組卵母細胞獲得的原核形成率(51.0％，53.4％vs.39.6％，35.3％)、卵裂率(41.3％，41.6％vs.28.1％，26.1％)及囊胚率(18.2％，19.3％vs.10.1％，11.1％)顯著高于與其他組(P<0.05)。以IVF胚胎為對照，對離子霉素+6-二甲基氨基嘌呤和乙醇+放線菌酮+細胞松弛素B激活獲得的孤雌胚胎進行染色體倍性分析和凋亡檢測。結果表明，與離子霉素+6-二甲基氨基嘌呤處理組相比，乙醇+放

10、線菌酮+細胞松弛素B處理組獲得了較低的單倍體率(7.4％vs.15.5％，P<0.05)和細胞凋亡率(7.0％vs.9.1％，P<0.05)。結果揭示，乙醇+放線菌酮+細胞松弛素B聯(lián)合激活是更有效的奶牛卵母細胞激活方法。
　　 4.優(yōu)化的卵母細胞體外成熟培養(yǎng)液和激活方法在奶?？寺〖夹g中的應用
　　 為了驗證篩選的Optimized SOFaa卵母細胞體外成熟培養(yǎng)液和激活方法用于奶牛體細胞核移植的可行性，將奶牛卵母細胞分別

11、培養(yǎng)于Optimized SOFaa培養(yǎng)液和傳統(tǒng)培養(yǎng)液(TCM-199+FBS)中，成熟后分別以卵丘細胞為供核細胞進行核移植，比較兩組重構胚的卵裂率及囊胚率，結果表明，Optimized SOFaa可用于核移植受體卵母細胞的成熟培養(yǎng)，并且用該培養(yǎng)液成熟的卵母細胞獲得了比傳統(tǒng)培養(yǎng)液成熟的卵母細胞更高的囊胚率(21.2％vs.14.3％，P<0.05)。優(yōu)化的激活策略也可以用于奶牛體細胞核移植。
　　 以Optimized SOFa

12、a培養(yǎng)液成熟的卵母細胞為受體，分別以成牛耳部成纖維細胞、輸卵管上皮細胞及卵丘細胞為供體，進行核移植，結果表明，供體細胞類型能影響核移植的效率，以卵丘細胞為供體獲得的囊胚率顯著高于另外兩種核供體(21.2％vs.15.9％，13.7％，P<0.05)，卵丘細胞更適合于作為奶牛體細胞核移植的供體細胞。分別用GO期卵丘細胞和正常生長的卵丘細胞為供體細胞進行了核移植，結果表明，核質互作能影響核移植的效率，GO期卵丘細胞為核供體獲得了較高的囊胚率

13、(21.2％vs.12.2％，P<0.05)。
　　 5.綠茶多酚對奶牛IVF和NT胚胎體外發(fā)育能力的影響及機理研究
　　 IVF和NT胚胎外生產時由于必須在可見光和高于體內的氧氣條件下操作，增加了胚胎細胞內活性氧(ROS)的產生。ROS對牛胚胎的毒害作用已經被廣泛證實，綠茶多酚(GTPs)是綠茶葉中分離提純的酚類化合物復合體，研究已經表明GTPs具有強的抗氧化活性，是有效的ROS（如O2、H2O、OH·和NO）清除劑。

14、為了研究GTPs對奶牛卵母細胞體外受精和植前胚胎早期發(fā)育的影響。分別在卵母細胞體外受精期間和IVF及NT胚胎培養(yǎng)期間向培養(yǎng)液中加入不同濃度的(0，10，15，20，25μM) GTPs，結果表明，在IVF培養(yǎng)液中添加不同濃度的GTPs均不能提高卵裂率及囊胚率；與對照組相比，添加15μM GTPs到IVF胚胎培養(yǎng)液中顯著提高了囊胚率(33.6％vs.24.8％，P<0.05)，但更高濃度GTPs（20或25μM）的添加并沒有進一步增加囊胚