營(yíng)養(yǎng)因素對(duì)奶牛卵母細(xì)胞體外發(fā)育和克隆效率的影響.pdf

1、奶牛體細(xì)胞核移植技術(shù)在加速品種改良、結(jié)合轉(zhuǎn)基因技術(shù)生產(chǎn)珍貴醫(yī)用蛋白等方面有著廣闊的應(yīng)用前景。但目前克隆效率低、流產(chǎn)率高、后代存活率低和出生后代發(fā)育異常等成為該項(xiàng)技術(shù)廣泛應(yīng)用的瓶頸。導(dǎo)致這一瓶頸的因素很多，其中現(xiàn)有卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)系統(tǒng)不能使卵母細(xì)胞，特別是卵胞質(zhì)達(dá)到成熟和激活方法不能完全激活核移植后的重構(gòu)胚是兩個(gè)重要因素，這兩個(gè)因素能引起核移植后核質(zhì)互作出現(xiàn)異常，導(dǎo)致重構(gòu)胚不能正確的實(shí)現(xiàn)重編程。因此，完善奶牛卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)系統(tǒng)，優(yōu)化

2、核移植后卵母細(xì)胞的激活方法，成為提高核移植效率的兩個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
　　 本研究依據(jù)現(xiàn)代細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)學(xué)理論，形成了一種無血清、化學(xué)成分明確的奶牛卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液，并優(yōu)化該培養(yǎng)液成熟培養(yǎng)的奶牛卵母細(xì)胞的激活條件。以體外培養(yǎng)的奶牛耳部成纖維細(xì)胞、輸卵管上皮細(xì)胞及卵丘細(xì)胞為供體細(xì)胞，進(jìn)行體細(xì)胞核移植證實(shí)了上述奶牛卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液和激活方法的可行性。同時(shí)，研究綠茶多酚對(duì)IVF及NT植前胚胎體外發(fā)育的影響及機(jī)理，為提高核移植胚胎體外發(fā)育率

3、提供理論依據(jù)。
　　 1.奶牛核移植供體細(xì)胞系的建立
　　 采用組織塊貼壁法從奶牛耳部組織分離成纖維細(xì)胞，采用機(jī)械法分離奶牛輸卵管上皮細(xì)胞，利用含血清的DMEM/F12培養(yǎng)液對(duì)兩種細(xì)胞進(jìn)行原代和續(xù)代培養(yǎng)：用胰蛋白酶消化液從卵泡中抽取的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合物分離卵丘細(xì)胞，利用改良的McCoy's5a培養(yǎng)液進(jìn)行原代和續(xù)代培養(yǎng)。傳代純化后分析三種細(xì)胞的形態(tài)特征、體外生長(zhǎng)曲線和染色體核型，結(jié)果表明，三種細(xì)胞的形態(tài)正常、體外生長(zhǎng)曲線

4、符合正常細(xì)胞的一般規(guī)律、染色體核型正常，均可作為體細(xì)胞核移植的供體細(xì)胞。
　　 2.無血清、化學(xué)成分明確的奶牛卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液的優(yōu)化
　　 用PVP-40代替血清，建立了一種化學(xué)成分明確的卵母細(xì)胞體外成熟基礎(chǔ)培養(yǎng)液(SOFaa-PVP-40)，分別單獨(dú)將不同濃度的葡萄糖(0mM、1.5mM、5.6mM和20mM)、IGF-I(0ng/mL、50ng/mL、100ng/mL和150ng/mL)、GTPs(0μM、10

5、μm、15μM和20μM)添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，對(duì)奶牛卵母細(xì)胞進(jìn)行IVM、IVF和IVC，以篩選三種物質(zhì)適宜的添加濃度。結(jié)果表明，獲得最高卵裂率和囊胚率的葡萄糖、IGF-I和GTPs添加濃度分別為5.6mM，100ng/mL、15μM。將三種物質(zhì)以優(yōu)化的濃度同時(shí)加入到基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，構(gòu)建一種無血清、化學(xué)成分明確的優(yōu)化培養(yǎng)液（Optimized SOFaa），以傳統(tǒng)的TCM-199+FBS培養(yǎng)液為對(duì)照，比較兩組培養(yǎng)液培養(yǎng)后的卵母細(xì)胞體外成熟率

6、、卵裂率、囊胚率及細(xì)胞內(nèi)GSH含量。結(jié)果表明，所構(gòu)建的卵母細(xì)胞優(yōu)化培養(yǎng)液可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)的TCM-199+FBS培養(yǎng)液用于奶牛卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)，并提高了成熟后卵母細(xì)胞的囊胚發(fā)育率(39.2％vs.30.4％，P<0.05)。卵母細(xì)胞發(fā)育能力的提高與細(xì)胞內(nèi)GSH含量的增加有關(guān)(14.3 pmol/oocyte-vs.8.9pmol/oocyte，P<0.05)。本研究的結(jié)果還證實(shí)，在秋季利用切剖法對(duì)卵巢表面直徑為3～6mm的卵泡采集卵母

7、細(xì)胞，可以獲得較好的卵母細(xì)胞數(shù)量、體外成熟率、體外受精后卵裂率及囊胚率。
　　 3.奶牛卵母細(xì)胞激活條件的優(yōu)化
　　 通過比較不同處理對(duì)卵母細(xì)胞激活及孤雌胚發(fā)育的影響篩選奶牛卵母細(xì)胞的激活方法。奶牛卵母細(xì)胞在Optimized SOFaa培養(yǎng)液中成熟并脫去卵丘細(xì)胞后按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行激活處理。以單一激活，成熟的卵母細(xì)胞用離子霉素(5μM，5min)，乙醇(7％，7min)，鈣離子載體A23187(5μM，5min)或鍶(1

8、0mM，5h)單獨(dú)激活試劑進(jìn)行處理。離子霉素和乙醇處理組獲得的原核形成率(39.4％，41.2％vs.21.3％，25.2％)和卵裂率(30.3％，28.1％vs.19.7％，23.7％)顯著高與另外兩組(P<0.05)。以聯(lián)合激活，用上述濃度的離子霉素和乙醇與6-二甲基氨基嘌呤(2.0mM，3h)或放線茵酮(10μg/mL)+細(xì)胞松弛素B(7.5μg/mL，3h)聯(lián)合處理卵母細(xì)胞。離子霉素+6-二甲基氨基嘌呤處理組和乙醇+放線菌酮+細(xì)

9、胞松弛素B處理組卵母細(xì)胞獲得的原核形成率(51.0％，53.4％vs.39.6％，35.3％)、卵裂率(41.3％，41.6％vs.28.1％，26.1％)及囊胚率(18.2％，19.3％vs.10.1％，11.1％)顯著高于與其他組(P<0.05)。以IVF胚胎為對(duì)照，對(duì)離子霉素+6-二甲基氨基嘌呤和乙醇+放線菌酮+細(xì)胞松弛素B激活獲得的孤雌胚胎進(jìn)行染色體倍性分析和凋亡檢測(cè)。結(jié)果表明，與離子霉素+6-二甲基氨基嘌呤處理組相比，乙醇+放

10、線菌酮+細(xì)胞松弛素B處理組獲得了較低的單倍體率(7.4％vs.15.5％，P<0.05)和細(xì)胞凋亡率(7.0％vs.9.1％，P<0.05)。結(jié)果揭示，乙醇+放線菌酮+細(xì)胞松弛素B聯(lián)合激活是更有效的奶牛卵母細(xì)胞激活方法。
　　 4.優(yōu)化的卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液和激活方法在奶?？寺〖夹g(shù)中的應(yīng)用
　　 為了驗(yàn)證篩選的Optimized SOFaa卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液和激活方法用于奶牛體細(xì)胞核移植的可行性，將奶牛卵母細(xì)胞分別

11、培養(yǎng)于Optimized SOFaa培養(yǎng)液和傳統(tǒng)培養(yǎng)液(TCM-199+FBS)中，成熟后分別以卵丘細(xì)胞為供核細(xì)胞進(jìn)行核移植，比較兩組重構(gòu)胚的卵裂率及囊胚率，結(jié)果表明，Optimized SOFaa可用于核移植受體卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)，并且用該培養(yǎng)液成熟的卵母細(xì)胞獲得了比傳統(tǒng)培養(yǎng)液成熟的卵母細(xì)胞更高的囊胚率(21.2％vs.14.3％，P<0.05)。優(yōu)化的激活策略也可以用于奶牛體細(xì)胞核移植。
　　 以O(shè)ptimized SOFa

12、a培養(yǎng)液成熟的卵母細(xì)胞為受體，分別以成牛耳部成纖維細(xì)胞、輸卵管上皮細(xì)胞及卵丘細(xì)胞為供體，進(jìn)行核移植，結(jié)果表明，供體細(xì)胞類型能影響核移植的效率，以卵丘細(xì)胞為供體獲得的囊胚率顯著高于另外兩種核供體(21.2％vs.15.9％，13.7％，P<0.05)，卵丘細(xì)胞更適合于作為奶牛體細(xì)胞核移植的供體細(xì)胞。分別用GO期卵丘細(xì)胞和正常生長(zhǎng)的卵丘細(xì)胞為供體細(xì)胞進(jìn)行了核移植，結(jié)果表明，核質(zhì)互作能影響核移植的效率，GO期卵丘細(xì)胞為核供體獲得了較高的囊胚率

13、(21.2％vs.12.2％，P<0.05)。
　　 5.綠茶多酚對(duì)奶牛IVF和NT胚胎體外發(fā)育能力的影響及機(jī)理研究
　　 IVF和NT胚胎外生產(chǎn)時(shí)由于必須在可見光和高于體內(nèi)的氧氣條件下操作，增加了胚胎細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的產(chǎn)生。ROS對(duì)牛胚胎的毒害作用已經(jīng)被廣泛證實(shí)，綠茶多酚(GTPs)是綠茶葉中分離提純的酚類化合物復(fù)合體，研究已經(jīng)表明GTPs具有強(qiáng)的抗氧化活性，是有效的ROS（如O2、H2O、OH·和NO）清除劑。

14、為了研究GTPs對(duì)奶牛卵母細(xì)胞體外受精和植前胚胎早期發(fā)育的影響。分別在卵母細(xì)胞體外受精期間和IVF及NT胚胎培養(yǎng)期間向培養(yǎng)液中加入不同濃度的(0，10，15，20，25μM) GTPs，結(jié)果表明，在IVF培養(yǎng)液中添加不同濃度的GTPs均不能提高卵裂率及囊胚率；與對(duì)照組相比，添加15μM GTPs到IVF胚胎培養(yǎng)液中顯著提高了囊胚率(33.6％vs.24.8％，P<0.05)，但更高濃度GTPs（20或25μM）的添加并沒有進(jìn)一步增加囊胚