下調(diào)Dlg1對豬卵母細(xì)胞體外發(fā)育的影響.pdf

1、哺乳動物腫瘤抑制基因Discs large homologue1(Dlg1)，是膜相關(guān)鳥苷酸激酶((membrane-associated guanylate kinase，MAGUK)家族的一員，通過PDZ區(qū)與其他分子相互作用參與微管極化，心體再定向以及細(xì)胞遷移。Dlg1突變時，會出現(xiàn)微絲和微管的異常組裝而導(dǎo)致的細(xì)胞極性異常，如:柱狀上皮細(xì)胞去極化和細(xì)胞粘附分子的異常分布(呂鴻2010)。小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中Dlg1表現(xiàn)為極性分

2、布，并且這種極性分布與細(xì)胞骨架微絲微管之間存在著密切關(guān)系。本研究以豬卵母細(xì)胞為材料，旨在觀察Dlg1在豬卵母細(xì)胞體外成熟和早期胚胎發(fā)育進(jìn)程中的表達(dá)定位，并在此基礎(chǔ)上通過RNA干擾技術(shù)，引入外源性siRNA，進(jìn)一步研究Dlg1在這兩個發(fā)育過程中的作用。試驗結(jié)果如下:
　　1、通過QRT-PCR檢測了豬多種組織細(xì)胞中Dlg1的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)卵巢組織和肺組織中Dlg1的表達(dá)量最高，PEF中表達(dá)量最低。
　　2、免疫熒光

3、染色檢測豬卵母細(xì)胞和早期胚胎中Dlg1的蛋白表達(dá)和分布。發(fā)現(xiàn)，在GV期豬卵母細(xì)胞中，Dlg1在整個胞質(zhì)和細(xì)胞核均勻分布，從GVBD～PreMⅠ開始到MⅡ胞質(zhì)中Dlg1逐漸向中心聚集，蛋白顆粒更明顯，皮質(zhì)處的分布明顯減少;孤雌激活后的早期胚胎中，Dlg1在整個胞質(zhì)彌散分布，但表達(dá)量逐漸下降2cell、4cell、囊胚期分別只有MⅡ期的46.9％、58.4％、29.66％。
　　3、通過QRT-PCR和免疫熒光染色方法來篩選Dlg1的

4、有效siRNA序列，結(jié)果顯示siRNA-2干擾效率最高，可分別在mRNA和蛋白水平上下調(diào)Dlg1表達(dá)的82.1％和61.28％。
　　4、通過顯微注射的方法將Dlg1 siRNA-2注射到GV期的豬卵母細(xì)胞胞漿和孤雌激活后2h的胚胎中。結(jié)果顯示:siRNA-2注射組的第一極體排出率為25.2％±3.3％，與對照組(73.4％±4.7％)相比顯著下降，說明下調(diào)Dlg1能顯抑制豬卵母細(xì)胞體外成熟。而且，免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)下調(diào)Dlg1后影