Nek9和ERK8在小鼠卵母細胞成熟中的作用和早期胚胎中定位.pdf

1、小鼠卵母細胞成熟是一多階段精細有序調(diào)控的過程。小鼠卵母細胞生發(fā)泡破裂標志著卵母細胞成熟的開始。生發(fā)泡破裂后，微管在前中期圍繞染色體開始組裝，染色體逐漸遷移至紡錘體的中部，而后者在MⅠ期形成橢圓形雙極結(jié)構(gòu)。隨后，紡錘體遷移至細胞皮質(zhì)，并排出第一極體，細胞進入第二次減數(shù)分裂中期，在此期紡錘體緊貼于質(zhì)膜下方。目前卵母細胞在胞漿中含有超過80個小的微管組織中心蛋白。有絲分裂體細胞中心體形成雙極紡錘體的兩極，促進微管成核和紡錘體裝配。減數(shù)分裂卵母

2、細胞微管組織中心含有圍中心粒物質(zhì)成分:γ-tubulin and pericentrin，后者是一種關(guān)鍵蛋白，用于把γ-tubulin固定在中心粒周圍。在前中期，微管組織中心開始聚集以形成紡錘體極。卵母細胞微管組織中心的功能與有絲分裂細胞中心體類似，對減數(shù)分裂紡錘體組裝是必須的，但微管組織中心的組成結(jié)構(gòu)及如何調(diào)節(jié)微管成核和組裝機制目前并沒有很好闡明。NIMA蛋白激酶是以構(gòu)巢曲霉菌蛋白激酶命名的一種激酶，參與廣泛的有絲分裂進程。哺乳動物的

3、NIMA基因編碼11種NIMA激酶，報道顯示NIMA蛋白激酶家族是有絲分裂進展中的關(guān)鍵分子，參與了許多重要的有絲分裂過程，如有絲分裂前期中的中心體分離，染色體濃縮，前中期中的核膜破裂和紡錘體組裝，以及有絲分裂周期的退出和細胞骨架分離。Nek9屬于NIMA蛋白激酶家族，是一分子量107kD的多肽，它的氨基催化末端連接有一段與RCC1同源的序列，后者是小G蛋白Ran的交換因子。在細胞分裂間期，Nek9的RCC1區(qū)域可以直接與激酶的活性部位結(jié)

4、合起自身抑制作用。哺乳動物細胞中發(fā)現(xiàn)Nek9與γ-tubulin蛋白共沉淀，并且激活的Nek9多肽在早期細胞分裂過程中定位于中心體和紡錘體極上。Nek6和Nek7激酶是Nek9的下游激酶，激活后促進有絲分裂進展，而如果敲減其活性或表達活性衰減的突變體則導(dǎo)致有絲分裂阻滯和細胞凋亡。PLK1激酶可以激活Nek9，促使有絲分裂驅(qū)動蛋白Eg5蛋白上Ser1033磷酸化，后者與CDK1激酶一起，對中心體分離和及時進入有絲分裂周期起關(guān)鍵作用。絲裂原

5、激活蛋白激酶系統(tǒng)(MAPK)是一組蘇/絡(luò)氨酸蛋白激酶家族，參與一系列的包括細胞增殖、分化、凋亡、應(yīng)激反應(yīng)等關(guān)鍵的細胞生命進程。ERK8是胞外信號調(diào)節(jié)激酶家族(ERK)中新發(fā)現(xiàn)的蛋白激酶，與ERK7擁有69％相同的氨基酸序列。ERK8促進增生細胞核抗原蛋白(proliferating cell nuclear antigen;PCNA)的穩(wěn)定，后者參與基因信息的傳送、協(xié)調(diào)、和刺激過程。目前已知(Humandouble minute2;HD

6、M2)蛋白參與PCNA降解過程。ERK8可以阻止PCNA和HDM2結(jié)合從而抑制PCNA降解。ERK8還參與調(diào)控細胞周期。降低ERK8表達影響正常的細胞增殖。在MCF-10A細胞，ERK8是調(diào)節(jié)增殖速率的限速因子，控制細胞進入S期。降調(diào)ERK8導(dǎo)致cyclin D1、cyclin E、p27表達增高，和cyclin A水平下調(diào)。降調(diào)ERK8表達后，細胞增殖速率下降大約2倍。不過，ERK8的功能仍不清楚，關(guān)于其上游激活成分和下游效應(yīng)蛋白的信

7、息仍了解很少。其在減數(shù)分裂中的作用也不清楚。考慮到減數(shù)分裂過程的精確調(diào)控對于可受精的卵子的產(chǎn)生及后代的健康十分重要。目前關(guān)于Nek9和ERK8激酶的研究主要集中在有絲分裂中方面，對于他們在哺乳動物減數(shù)分裂中的作用及其在早期受精卵中的研究尚未見報道，我們提出了Nek9和ERK8在小鼠卵母細胞減數(shù)分裂過程和早期受精卵卵裂中發(fā)揮作用的假設(shè)。系統(tǒng)研究了他們在小鼠卵母細胞減數(shù)分裂過程中的表達、定位、功能情況以及其在受精卵早期胚胎中的分布情況。本研

8、究包括兩個部分。
　　 第一章 Nek9調(diào)節(jié)小鼠卵母細胞減數(shù)分裂紡錘體組裝和細胞周期進展及其在早期胚胎中的分布
　　 目的:Nek9在有絲分裂中起重要作用，但其是否參與減數(shù)分裂過程中無中心體的紡錘體組裝和染色體的分離調(diào)控還有待研究。本研究探討其在小鼠卵母細胞減數(shù)分裂過程中的表達、定位、功能情況以及其在受精卵早期胚胎中的分布情況。
　　 方法:我們先后進行卵母細胞和受精卵培養(yǎng)、對各期卵母細胞或受精卵早期胚胎進行免疫

9、印跡試驗、免疫熒光試驗和激光共聚焦掃描檢測;紫杉醇和諾考達唑處理減數(shù)分裂中期的卵母細胞;Morpholino顯微注射、染色體鋪片實驗、活細胞動態(tài)觀察錄像實驗等實驗方法，探討其在小鼠卵母細胞減數(shù)分裂過程具體的作用和早期受精卵卵裂中的分布。獨立重復(fù)的實驗數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標準誤表示，觀察的卵子數(shù)目用括號表示(n=)。用SPSS軟件進行差異分析。p＜0.05被定義為差異顯著。
　　 實驗結(jié)果:Nek9在小鼠卵母細胞減數(shù)分裂成熟中均有表達和

10、定位:Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)，Nek9在卵母細胞成熟的各個階段都有表達，且各期表達量并無明顯差異。免疫熒光實驗顯示GⅤ期，Nek9定位在生發(fā)泡內(nèi)。生發(fā)泡破裂后，Nek9聚集在濃縮的染色體周圍，在Pro-MⅠ、MⅠ期，Nek9主要定位在紡綞體的兩極上。在在第一次減數(shù)分裂的后期和末期，Nek9主要定位在分離的同源染色體中間和卵母細胞和極體間的中體上。在MⅡ期，Nek9再次回到紡綞體的兩極上。Nek9與γ-tubulin共定位進一步證

11、實Nek9在減數(shù)分裂期主要分布在紡錘體的兩極上。Nek9在受精卵和早期有絲分裂期胚胎中的亞細胞定位與卵母細胞減數(shù)分裂相類似。當卵母細胞進入第二次減數(shù)分裂的末期并排出第二極體，Nek9遷移至細胞中體上。在受精卵兩原核期中，Nek9呈點狀分布在受精卵原核內(nèi)。隨著原核的破裂，Nek9開始在染色體周圍聚集，有絲分裂紡錘體開始形成。在前中期和中期，Nek9穩(wěn)定的表達在第一次有絲分裂紡錘體的兩極上。當合子進入第一次有絲分裂后期和末期時，Nek9移動

12、到已分離染色體之間的中部或細胞中體，當?shù)谝淮斡薪z分裂完成后，受精卵形成2細胞胚胎間期，Nek9再一次出現(xiàn)在細胞核內(nèi)。當用紡錘體干擾劑處理減數(shù)分裂中期中的卵母細胞后，我們發(fā)現(xiàn)在紫杉醇處理組的卵子中，Nek9和γ-tubulin信號不僅在異常的紡錘體極上出現(xiàn)并完全重疊，同時也出現(xiàn)在異常的胞質(zhì)星體上。在諾考達唑處理的卵子，微管完全解聚，紡錘體消失，Nek9信號消失在胞漿中。當諾考達唑處理的MⅠ期卵子徹底清洗并培養(yǎng)30分鐘來促進微管的再組裝，N

13、ek9又重新出現(xiàn)在重組的紡錘體細胞器的兩極上。接下來我們采用在卵子中采用Morpholino(MO)抑制Nek9表達，觀察卵母細胞Nek9受到抑制后其減數(shù)分裂的發(fā)生情況。免疫印跡分析顯示Morpholino處理組Nek9的表達明顯降低，證明Nek9敲減效率是成功的。在Nek9-MO處理組，卵母細胞表現(xiàn)出多種形態(tài)異常的有缺陷的紡錘體和排列紊亂的染色體。主要的紡錘體紊亂是異常的紡錘體極，(52％，n=94)主要包括:無極，單級，多極紡錘體，

14、其他紊亂包括超長的紡錘體，和異形的紡錘體伴有星型微管，并出現(xiàn)明顯的染色體排列異常。Nek9-MO注射處理組異常紡錘體的比例(62.2±1.6％，n=94)明顯高于對照組(26.1±1.3％，n=92)(p＜0.05)。而且，Nek9-MO處理組排列紊亂染色體的比例(69.2±0.6％，n=94)與對照組相比(28.1±2.3％，n=92)也有顯著差異。我們的研究發(fā)現(xiàn)，Nek9在減數(shù)分裂成熟過程中始終和γ-tubulin共定位，接下來，我

15、們進一步研究了Nek9敲減后對γ-tubulin的作用。在對照MO組，γ-tubulin在MⅠ期位于紡錘體的兩極，而在Nek9-MO顯微注射處理組，γ-tubulin不再聚集在紡錘體的兩極，而是不規(guī)則的散落在紡錘體纖維上或彌散在細胞漿中。由于Nek9敲減影響了紡錘體組裝而導(dǎo)致大量卵子阻滯在前中期和中期，我們推測染色體是否也不能得到正確的分離。我們將Nek9MO處理組和對照組的卵子培養(yǎng)12小時后進行染色體鋪片分析。染色體鋪片證實Nek9降

16、調(diào)后影響了染色體分離。在Nek9降調(diào)組，染色體鋪片顯示染色體仍為2倍體，(10/10);而在對照組卵母細胞，同源染色體已分離，染色體為單倍體形式(9/9)，提示后期已完成。接下來，我們研究了檢驗點蛋白Bub3在Nek9-MO處理組卵母細胞的分布情況。在Nek9-MO實驗組，細胞即使經(jīng)過10小時培養(yǎng)仍阻滯在前中期或中期，特異性的檢驗點蛋白Bub3信號仍可以被檢測出。而在對照組，細胞進入后期，Bub3信號消失， Bub3信號提示在Nek9降

17、調(diào)后，紡錘體檢驗點被激活。最后，我們采用活細胞實時攝像顯示:在對照組，生發(fā)泡破裂后4小時可觀察到減數(shù)分裂紡錘體，并且紡錘體緩慢移至卵子皮質(zhì)，并大約在生發(fā)泡破裂后9小時排出第一極體。形成對比的是，在Nek9-MO顯微注射處理組，各種不同的形態(tài)缺陷的紡錘體可以被觀察到，染色體不能分離，甚至在生發(fā)泡破裂后12小時后還能發(fā)現(xiàn)卵子被阻滯在前中期或中期。而且，在Nek9-MO顯微注射處理組中，沒有發(fā)現(xiàn)有第一極體排出。
　　 結(jié)論:我們的研究

18、顯示Nek9可能是一種中心體相關(guān)蛋白，在小鼠卵母細胞減數(shù)分裂過程中對紡錘體組裝，紡錘體極形成，染色體排列，第一極體排出都起重要作用。
　　 第二章ERK8在小鼠卵母細胞減數(shù)分裂中的作用和在早期胚胎中的分布
　　 目的:研究ERK8在小鼠卵母細胞減數(shù)分裂過程中的表達、定位、在受精卵早期胚胎中的分布情況，以及其在卵母細胞減數(shù)分裂成熟過程中的作用。
　　 方法:我們先后進行卵母細胞和受精卵培養(yǎng)、對各期卵母細胞或受精卵早

19、期胚胎進行免疫印跡試驗、免疫熒光試驗和激光共聚焦檢測、紫杉醇和諾考達唑處理減數(shù)分裂中期的卵母細胞、siRNA或抗體顯微注射等實驗方法，探討其在小鼠卵母細胞減數(shù)分裂過程具體的作用和早期受精卵卵裂中的分布。獨立重復(fù)的實驗數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標準誤表示，觀察的卵子數(shù)目用括號表示(n=)。用SPSS軟件進行差異分析。p＜0.05被定義為差異顯著。
　　 結(jié)果:ERK8實驗結(jié)果顯示:ERK8在卵母細胞成熟的各個階段都有表達，且各期表達量并無明顯

20、差異。免疫熒光實驗顯示在GⅤ期，ERK8未發(fā)現(xiàn)有明確的定位。在生發(fā)泡破裂后，ERK8開始遷移至染色體的周圍。在第一次減數(shù)分裂前中期、中期、后期、末期和第二次減數(shù)分裂中期，ERK8穩(wěn)定地分布在紡錘體微管上。ERK8信號和α-tubulin信號共染實驗進一步證實ERK8在減數(shù)分裂中的定位。受精卵和早期有絲分裂期胚胎免疫熒光實驗顯示在兩原核期受精卵，未發(fā)現(xiàn)明顯的ERK8信號。當原核核膜破裂后，ERK8開始聚集在染色體的周圍并開始定位在有絲分裂

21、紡錘體微管上。當受精卵進入有絲分裂后期， ERK8信號仍和α-tubulin有著同樣的定位方式。當?shù)谝淮斡薪z分裂完成，形成二細胞胚胎且細胞均進入間期時，和在原核期類似，此時無ERK8信號被檢測到。在觀察到ERK8在第一次和第二次減數(shù)分裂中期均定位在紡錘體上之后，我們研究了其與微管的相關(guān)關(guān)系。紫杉醇是一種微管穩(wěn)定劑，紫杉醇處理的卵母細胞微管紡錘體過度聚集，并且在胞質(zhì)中形成典型和眾多的星體，ERK8信號出現(xiàn)在異常的紡錘體上和胞質(zhì)星體上。接下

22、來，用諾考達唑處理MⅠ和MⅡ期卵母細胞使其微管降解，經(jīng)過10分鐘諾考達唑處理，微管已完全解聚，此時ERK8從紡錘體消失，彌散在胞質(zhì)中。為了研究ERK8在小鼠卵母細胞減數(shù)分裂中的作用，我們首先采用抗體注射破壞ERK8蛋白的生物學(xué)活性。我們用ERK8抗體或免疫球蛋白G注射生發(fā)泡期的卵母細胞。在ERK8抗體注射組，卵母細胞顯示出各種不同類型的紡錘體缺陷和排列異常的染色體表型。主要的紡錘體異常是無極紡錘體。其他的異常包括單極紡錘體、多極紡錘體、

23、多極紡錘體和小紡錘體、長紡錘體和非成型的紡錘體伴有胞質(zhì)星體。ERK8抗體注射組在出現(xiàn)嚴重紡錘體異常的同時多半也伴有染色體排列紊亂，包括輕度排列紊亂和嚴重排列異常。與對照組(23.2％±2.7％，n=217)相比， ERK8抗體注射組(57.1％±4.9％，n=185，p＜0.05)紡錘體異常比例明顯增高，有統(tǒng)計學(xué)差異。ERK8抗體注射組中(60.4％±3.8％,n=185)染色體異常比例同時也較對照組(20.6％±1.8％，n=217，

24、p＜0.05)明顯增加。我們進一步采用ERK8 siRNA干擾觀察卵母細胞減數(shù)分裂成熟情況。在ERK8-siRNA降調(diào)組，大多數(shù)卵母細胞表現(xiàn)出明顯異常的紡錘體和染色體表型。ERK8-siRNA顯微注射組異常紡錘體比例(59.3±3.5％，n=159)較對照組(25.3±1.5％，n=155)明顯增加，(p＜0.05)。ERK8 siRNA降調(diào)組染色體異常比例(60.5±3.8％，n=159)與對照組(30.6±3.4％，n=155，p＜

25、0.05)相比，也明顯增加。最后，我們發(fā)現(xiàn)大多數(shù)ERK8 siRNA組卵母細胞被阻滯在前中期/中期，而對照組細胞多數(shù)進入MⅡ期，ERK8 siRNA組極體排放率(31.1±2.8％，n=144)明顯低于對照組極體排放率(63.4±4.2％，n=157，p＜0.05)。與ERK8 siRNA干擾試驗結(jié)果相似，ERK8抗體顯微注射組的極體排放率(35.3±5.7％，n=114)明顯低于對照免疫球蛋白注射組(72.7±2.8％，n=125，p