小鼠生發(fā)泡完整卵母細胞中母源基因克隆、定位和功能.pdf

1、目的:伴隨卵母細胞生長的是核糖體和mRNAs轉(zhuǎn)錄活化,小鼠大約在排卵前6天,卵母細胞生長和分化結(jié)束而達到成熟,此時卵母細胞中合成和積累了多種RNA、蛋白質(zhì)和細胞器,這些構(gòu)成了早期胚胎發(fā)育的母源物質(zhì).胚胎發(fā)育從受精開始,新受精卵中就存儲大量的母源物質(zhì),隨著胚胎進一步發(fā)育,母源mRNAs逐漸消耗,必然需要合子基因組的適時表達并完全取代之,以實現(xiàn)由母型向合子型調(diào)控過渡,缺乏合子基因組激活的動物胚胎無法進一步發(fā)育.已有研究表明,小鼠合子基因組激

2、活發(fā)生于1-細胞晚期,從未受精卵到單細胞胚胎是母源物質(zhì)控制,由母源物質(zhì)支持并指導(dǎo)了早期胚胎發(fā)育直到合子基因組激活.因此,母源物質(zhì)對早期胚胎發(fā)育的作用日益受到重視,但對早期胚胎發(fā)育或?qū)β涯讣毎蚝献舆^渡有影響的作用的母源基因極少被克隆或識別.方法:21、應(yīng)用抑制消減雜交技術(shù)(SSH),以生發(fā)泡完整的卵母細胞為檢測子(Tester),8-細胞胚胎為驅(qū)趕子(Driver),建立GV卵母源基因的消減cDNA文庫.通過斑點雜交法進一步篩選GV卵中

3、母源基因的消減cDNA文庫,對陽性克隆進行序列測定和同源性分析;并隨機選取3個克隆,以其cDNA序列為基礎(chǔ)設(shè)計引物,采用RT-PCR方法對SSH的結(jié)果進行驗證.2、根據(jù)小鼠Peroxiredoxin Ⅱ mRNA序列(Accession No:BC002034)設(shè)計引物,對小鼠生發(fā)泡完整卵母細胞(GerminalVesicle intact oocyte,GV卵)中的Peroxiredoxin Ⅱ可能編碼區(qū)進行擴增.另外取小鼠的卵巢,石

4、蠟包埋切片,分別應(yīng)用原位雜交方法和免疫組織化學染色觀察Peroxiredoxin Ⅱ mRNA和蛋白在卵巢各級卵泡中的分布.同時,運用RT-PCR和免疫細胞化學染色方法觀察Peroxiredoxin Ⅱ在植入前胚胎的表達.3、收集昆明白小鼠的單細胞受精卵,采用微滴培養(yǎng)法連續(xù)培養(yǎng)48h,觀察Peroxiredoxin Ⅱ抗體對胚胎發(fā)育的影響.應(yīng)用共聚焦掃描顯微鏡術(shù)結(jié)合特異性熒光探針2','二氯熒光黃雙乙酸酯,觀測Peroxiredoxin

5、 Ⅱ抗體對小鼠胚胎中活性氧自由基水平的影響.結(jié)論:1、應(yīng)用抑制性消減雜交技術(shù),我們成功建立小鼠GV卵中母源基因的消減cDNA文庫,為我們進一步研究母源基因在卵母細胞和早期胚胎發(fā)育中的作用奠定基礎(chǔ).2、Peroxiredoxin Ⅱ mRNA是母源性遺傳信息,小鼠卵巢內(nèi)Peroxiredoxin Ⅱ mRNA的轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯始于初級卵泡中的卵母4細胞,并持續(xù)到近成熟卵泡.Peroxiredoxin蛋白是母源性蛋白,植入前胚胎中的Perox