用膜濾過聯(lián)合激光掃描細(xì)胞計量儀檢測惡性腫瘤患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞.pdf

1、目的：建立用膜濾過分離腫瘤細(xì)胞技術(shù)(Isolationbysizeofepithelialtumorcells，ISET)聯(lián)合激光掃描細(xì)胞計量儀(LaserScanningCytometryLSC)檢測循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulatingtumorcellsCTC)的方法，運(yùn)用該方法檢測腫瘤患者的CTC，并探討CTC數(shù)量與患者的臨床分期、原發(fā)腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等的關(guān)系。 方法：(1)用ISET技術(shù)(孔徑8um的聚碳酸酯濾膜濾過

2、標(biāo)本)初步分選出腫瘤細(xì)胞后，用細(xì)胞角蛋白8(Cytokeratins8，CK8)抗體和白細(xì)胞共同抗原CD45(leukocytecommonantigen，LCA)抗體染色并用核酸染料DAPI(4，6-diamidino-2-phenylindole4’，6二脒基苯基吲哚)進(jìn)行細(xì)胞核染色后用LSC進(jìn)行掃描分析，選出CK8+且CD45-的細(xì)胞為陽性細(xì)胞，后根據(jù)DAPI染色后細(xì)胞核形態(tài)、大小等最終確認(rèn)腫瘤細(xì)胞。(2)將不同數(shù)量的乳腺癌細(xì)胞系

3、(MCF-7)細(xì)胞混入健康血標(biāo)本中，用建立的方法檢測以驗證該方法細(xì)胞回收率及檢測敏感性和特異性。(3)用該方法檢測50例有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的晚期腫瘤(IV期)患者(其中乳腺癌患者25例)、22例可手術(shù)的腫瘤(I-III期)患者(其中乳腺癌患者20例)的CTC和30例健康者作為正常對照，分析CTC數(shù)量與腫瘤患者臨床分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床因素之間的關(guān)系。 結(jié)果：(1)8um孔徑的聚碳酸酯濾膜能濾過99％的正常外周血白細(xì)胞而留住97

4、％的腫瘤細(xì)胞，CK8抗體對腫瘤細(xì)胞、CD45抗體對粒細(xì)胞染色特異性均達(dá)到99％以上，通過LSC掃描分析所得陽性細(xì)胞(CK8+且CD45-)可經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察最終確認(rèn)為腫瘤細(xì)胞。(2)通過多次對混入不同數(shù)量腫瘤細(xì)胞的模擬標(biāo)本檢測的結(jié)果顯示該方法的腫瘤細(xì)胞回收率為10.34±1.15％，在混入60-600000個腫瘤細(xì)胞范圍內(nèi)回收率保持穩(wěn)定(P>0.05)；該方法敏感性高，特異性強(qiáng)，可檢測到1ml血中一個腫瘤細(xì)胞而相同條件下空白對照組均未檢出腫

5、瘤細(xì)胞。(3)臨床標(biāo)本檢測顯示，50例Ⅳ期腫瘤患者有39例(78％)檢出CTC，22例Ⅰ-Ⅲ期腫瘤患者有11例(50％)檢出CTC，30例健康者均未檢測到CTC(0％)。腫瘤患者CTC檢出率均明顯高于健康對照組(P<0.05)，Ⅳ期腫瘤患者CTC檢出率高于Ⅰ-Ⅲ期腫瘤患者(P<0.05)。(4)45例乳腺癌患者隨著臨床分期的增高，CTC數(shù)量逐漸增高；Ⅳ期患者的CTC數(shù)量(8.60±1.39)明顯高于Ⅰ-Ⅲ期患者(3.45±1.08)(P

6、<0.05)；Ⅲ期-Ⅳ期患者CTC數(shù)量(8.44±1.33)也顯著高于Ⅰ-Ⅱ期患者CTC數(shù)量(3.11±1.05)(P<0.05)；此外，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況患者的CTC數(shù)量(7.63±1.26)顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(2.80±1.46)(P<0.05)，而腫瘤大小不同、以及激素受體和Her-2表達(dá)水平不同的患者之間CTC數(shù)量未見顯著性差別(P均>0.05)。 結(jié)論：(1)用膜濾過聯(lián)合激光掃描細(xì)胞計量儀檢測惡性腫瘤患者CTC方法