萊克多巴胺免疫PCR檢測(cè)方法學(xué)基礎(chǔ)研究.pdf

1、萊克多巴胺(ractopamine，RAC)屬于苯乙醇胺類β-受體激動(dòng)劑，作為動(dòng)物飼料添加劑，可以提高食用動(dòng)物的瘦肉轉(zhuǎn)化率。長(zhǎng)期或大量喂藥后，動(dòng)物體內(nèi)的殘留會(huì)隨食物鏈在人體內(nèi)蓄積，造成巨大危害，威脅人類健康。目前，歐盟及中國(guó)等國(guó)家已明確禁止將此物質(zhì)添加在飼料和動(dòng)物飲水中。
　　本論文在酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)的基礎(chǔ)上，對(duì)實(shí)時(shí)熒光免疫 PCR為和免疫LAMP測(cè)定萊克多巴胺的方法進(jìn)行了研究，獲得了以下結(jié)果：
　　1、借助多元

2、酸酐法引入羧基制備萊克多巴胺半抗原(RAC-戊二酸酐半醛)，后用混合酸酐方法將半抗原同載體蛋白(BSA與OVA)偶聯(lián)，分別合成了免疫原RAC-BSA和包被原RAC-OVA。采用常規(guī)辦法免疫新西蘭大白兔，獲得了良好效價(jià)的多克隆抗體anti-RAC pAb。
　　2、混合酸酐法連接RAC與HRP。利用該酶標(biāo)抗原與多克隆抗體建立了直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法，以檢測(cè)萊克多巴胺殘留。結(jié)果表明，此方法IC50值為1.1ng/mL，最低檢測(cè)限(LOD

3、)為0.19ng/mL。此方法對(duì) RAC有高特異性，同其他16種β-興奮劑的交叉反應(yīng)率均在0.1％以下。實(shí)際樣品檢測(cè)時(shí)，板內(nèi)回收率在79%-94%，為可接受范圍。板內(nèi)變異系數(shù)在0.9-4.7%間，板間變異系數(shù)在3.1-5.1%，證明該方法重復(fù)性良好。
　　3、本研究在酶聯(lián)免疫方法的基礎(chǔ)上，用熒光定量PCR作為信號(hào)檢測(cè)手段，建立實(shí)時(shí)定量免疫PCR法檢測(cè)RAC。采用PCR引物5’-端標(biāo)記生物素的方法和N-羥基琥珀酰亞胺活性酯化法分別制

4、備生物素標(biāo)記 DNA及生物素化多克隆抗體。以鏈霉親和素和生物素系統(tǒng)為實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，完成抗原抗體結(jié)合的信號(hào)放大。針對(duì)反應(yīng)的主要參數(shù)，包括反應(yīng)載體、標(biāo)記抗體與抗原的濃度、親和素濃度、洗板次數(shù)、Bio-DNA濃度等因素進(jìn)行優(yōu)化，最終建立 rt-IPCR反應(yīng)體系：選用戊二醛0.6%處理PCR管反應(yīng)，以2μg/mL檢測(cè)抗原進(jìn)行包被，加入0.326μg/mL生物素化抗體進(jìn)行反應(yīng)后，選擇濃度為2.57μg/mL親和素將生物素抗體與0.35ng的Bio-D

5、NA結(jié)合起來(lái)，最終用PBST與ddH2O分別洗滌5次。經(jīng)檢測(cè)，該方法的最低檢測(cè)限(LOD)為0.0039ng/mL，IC50=0.18ng/mL。與競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法相比，提高了兩個(gè)數(shù)量級(jí)。該方法中，RAC-多克隆抗體對(duì) RAC有很高的特異性，與其他16種β-受體激動(dòng)劑物質(zhì)沒(méi)有交叉反應(yīng)(CR＜0.018%)。添加回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在RAC濃度為0.25-1.0ng/mL時(shí)，板內(nèi)回收率在80-120%，板內(nèi)及板間變異系數(shù)(CV%)小于10

6、%。
　　4、選擇合成的生物素化DNA設(shè)計(jì)LAMP引物，對(duì)LAMP反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，確定反應(yīng)體系為：0.2mmol/外引物(F3/B3),1.6mmol/L內(nèi)引物(FIP/BIP),1.4mmol/LdNTPs,0.6MBetaine,8mmol/LMgSO4,10mmol/LKCl,20mmol/LTris-HCl,10mmol/L(NH4)2SO4,0.1%Tween20,8UBstDNA Polymerase,200?mol

7、/L Calcein,500?mol/LMnCl2,template2.5?L,ddH2O補(bǔ)足25μL。實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過(guò)SYBR Green熒光通道采用熒光定量 PCR儀檢測(cè)。以梯度稀釋的Bio-DNA為模板，測(cè)得可視化LAMP檢測(cè)法的靈敏度為1.0×104 copies/μL。將此方法應(yīng)用于免疫PCR核酸檢測(cè)中，最低檢測(cè)限(LOD)為0.0079ng.mL，IC50=0.41ng/mL。與競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法相比，提高了約一個(gè)數(shù)量級(jí)。該方法