萊克多巴胺兔單抗的制備與ELISA檢測方法的建立.pdf

1、萊克多巴胺屬于雙苯烷胺類的β-腎上腺素受體激動(dòng)劑(簡稱β-激動(dòng)劑)，具有廣泛的生理效應(yīng)，常被用于支氣管哮喘、支氣管痙攣和產(chǎn)科疾病的治療。當(dāng)其用量為臨床用量的5-10倍時(shí)，又是良好的營養(yǎng)重分配劑和生長促進(jìn)劑。其在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的殘留一旦通過食物鏈進(jìn)入人體，會(huì)對(duì)食用者的安全產(chǎn)生極大的危害，特別對(duì)心臟病、糖尿病、高血壓、甲亢、青光眼、前列腺肥大等病人或老人兒童危害更大，甚至?xí)?dǎo)致死亡。目前我國禁止將β-激動(dòng)劑等藥物作為動(dòng)物促生長劑使用。但長期以來

2、，各種因非法使用β-激動(dòng)劑而造成的中毒事件時(shí)有發(fā)生。為了打擊非法用藥，保護(hù)消費(fèi)者的健康安全，迫切需要健全相關(guān)的檢測方法。萊克多巴胺的檢測方法與克倫特羅等其他β-激動(dòng)劑相比較滯后，目前我國還沒有萊克多巴胺的國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法。因此，建立快速、靈敏、特異、有效的萊克多巴胺殘留檢測方法具有深遠(yuǎn)的理論意義和現(xiàn)實(shí)意義。 本研究合成了萊克多巴胺的人工抗原，通過免疫兔子獲得了免疫脾臟，利用雜交瘤技術(shù)制備了萊克多巴胺的兔單克隆抗體，建立了萊克多巴

3、胺的ELISA檢測技術(shù)，并初步構(gòu)建了萊克多巴胺的ELISA檢測試劑盒。其主要研究結(jié)果如下： 1.采用混合酸酐法合成了兩種萊克多巴胺的人工抗原，其中一種為萊克多巴胺-BSA作為免疫抗原，另一種為萊克多巴胺-OVA作為包被抗原。通過紫外掃描法、紅外掃描法和Agilent2100生化分析儀芯片實(shí)驗(yàn)室試劑盒對(duì)人工抗原進(jìn)行了鑒定，證實(shí)了人工抗原合成成功，測得免疫抗原分子質(zhì)量為76.4kDa，并估算得到半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)比率為28∶1。

4、采用考馬斯亮藍(lán)法對(duì)合成抗原中蛋白質(zhì)的含量進(jìn)行測定，得到免疫抗原中蛋白質(zhì)的濃度是3.62mg/mL，包被抗原中蛋白質(zhì)的濃度是1.156mg/mL。 2.用合成的免疫抗原采用背部皮下注射、胭淋巴結(jié)注射和耳緣靜脈注射相結(jié)合的方法免疫WHB黑眼大白兔，。免疫七次后，獲得了高效價(jià)的萊克多巴胺多克隆抗血清，其中5號(hào)抗血清的效價(jià)為1∶32×104，6號(hào)抗血清的效價(jià)為1∶16×104。并采用飽和硫酸銨法初步純化抗血清。 3.通過免疫WH

5、B黑眼大白兔，同時(shí)獲得了兔子的免疫脾臟，將脾細(xì)胞與處于對(duì)數(shù)生長期的兔骨髓瘤細(xì)胞240E進(jìn)行細(xì)胞融合，并分裝于40塊96孔板中(助融劑為50％的PEG)。用HAT作為選擇性培養(yǎng)基對(duì)融合后的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。利用間接ELISA、間接競爭ELISA和IgG定量等方法篩選克隆孔，初次篩選得到116個(gè)陽性孔。通過兩次Sub克隆后，最終篩選出A3-2-4，A3-2-6，B5-4-4和B5-4-5共四株高特異性的雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)反復(fù)凍存及復(fù)蘇，雜交瘤細(xì)胞分

6、泌抗體穩(wěn)定。通過體外培養(yǎng)法擴(kuò)大生產(chǎn)兔單克隆抗體。 4.對(duì)ELISA檢測條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到的最佳反應(yīng)條件為：包被時(shí)間4℃12h，一抗作用時(shí)間60min，二抗作用時(shí)間100min，底物作用時(shí)間15min。因?yàn)榈孜锝M成對(duì)ELISA檢測的靈敏度有較大影響，所以試驗(yàn)還對(duì)底物配方進(jìn)行了優(yōu)化，得到TMB和H2O2的最佳組合為0.25g/L的TMB+0.02％的H2O的結(jié)論。 5.采用間接ELISA法測定了A3-2-4，A3-2-6，

7、B5-4-4和B5-4-5四株雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中兔單克隆抗體的效價(jià)和工作濃度，它們分別為：1∶1600，1∶3200，1∶50和1∶100。用間接競爭ELISA法測定4株雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中兔單克隆抗體的競爭抑制曲線，4條曲線均呈典型的S型，且＜20ng/mL的萊克多巴胺就能對(duì)4株雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中的兔單克隆抗體產(chǎn)生50％的抑制率，說明4株雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中的兔單克隆抗體具有較好的親和性。 6.采用間接競爭ELISA法建立

8、了A3-2-6兔單克隆抗體的間接競爭標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線在0.1～100ng/mL之間顯示了良好的線性，達(dá)到10％抑制率時(shí)，萊克多巴胺的濃度為0.2227ng/mL，而濃度為4.0907ng/mL時(shí)即可達(dá)到50％的抑制率。 7.采用間接競爭ELISA法對(duì)A3-2-6兔單克隆抗體的特異性進(jìn)行了測定。A3-2-6兔單克隆抗體除了與多巴酚丁胺有32.23％的交叉反應(yīng)率外，與鹽酸克倫特羅、苯氧丙酚胺、腎上腺素、去甲腎上腺素、異丙腎上腺素、多巴

9、胺和沙丁胺醇等結(jié)構(gòu)相差稍大的類似物均沒有交叉反應(yīng)性。A3-2-6兔單抗與鹽酸麻黃堿、氨芐西林鈉、青霉素鈉、苯唑西林鈉、阿莫西林鈉、硫酸鏈霉素和硫酸卡那霉素等常用獸藥也沒有交叉反應(yīng)率，說明本試驗(yàn)制備的萊克多巴胺兔單克隆抗體具有較好的特異性。 8.對(duì)間接ELISA法測定樣品的準(zhǔn)確度進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明不同濃度的尿樣檢測的回收率均很高，在94.76-110.22％之間。除了添加5ng/mL的樣品變異系數(shù)為15.02％外，其余添加樣品的變