抗重金屬Hg2+單抗制備及ELISA檢測方法的建立.pdf

1、重金屬汞（Hg）既是人們生產(chǎn)生活的必需重要元素，也是嚴(yán)重危害環(huán)境的元素之一。隨著汞的廣泛使用，其對(duì)環(huán)境的污染越來越嚴(yán)重，通過食物鏈進(jìn)行循環(huán)富集作用，給人類健康構(gòu)成威脅。鑒于傳統(tǒng)的儀器檢測方法存在成本貴、實(shí)驗(yàn)要求高等諸多缺點(diǎn)，本文通過細(xì)胞融合技術(shù)制備抗汞離子單克隆抗體，結(jié)合免疫學(xué)技術(shù)原理方法，建立了ELISA檢測方法，進(jìn)一步完善了重金屬汞離子的檢測方法，為臨床環(huán)境或畜產(chǎn)品中批量、快速、高效檢測提供有效支持。
　　為建立汞離子免疫學(xué)檢

2、測方法，通過分析重金屬汞離子結(jié)構(gòu)特征，采用異硫氰酯法將雙功能螯合劑ITCBE與汞離子螯合形成半抗原，然后將其與牛血清白蛋白（BSA）和卵清蛋白（0VA）偶聯(lián)合成人工免疫原Hg2+-ITCBE-BSA和包被原Hg2+-ITCBE-OVA，用紫外（UV）、電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）和凝膠電泳（SDS-PAGE）進(jìn)行鑒定；用Hg2+-ITCBE-BSA免疫BALB/C小鼠，間接ELISA測定多抗（pAb）效價(jià)，阻斷 ELISA鑒定

3、其敏感性，交叉反應(yīng)試驗(yàn)鑒定其特異性。結(jié)果表明，免疫原Hg2+-ITCBE-BSA和包被原 Hg2+-ITCBE-OVA制備成功。Hg2+-ITCBE-BSA中 BSA和Hg2+的含量分別為9.09 g/L和45.88 mg/L；間接ELISA效價(jià)達(dá)到1∶（1.024×105），阻斷ELISA檢測Hg-EDTA的IC50為45.49 ng/mL。成功制備汞離子人工完全免疫原。
　　用Hg2+-ITCBE-BSA免疫Balb/C小鼠，

4、通過ELISA篩選出間接效價(jià)最高、阻斷效價(jià)最低的小鼠，無菌制備脾臟細(xì)胞，與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合。通過檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清效價(jià)和抑制效價(jià)，篩選出兩株高靈敏性的雜交瘤細(xì)胞株3B1E5、2G6C3。通過誘生腹水法獲取大量單抗，并對(duì)其免疫學(xué)特性進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，3B1E5細(xì)胞株效價(jià)最好，間接效價(jià)達(dá)到1∶（5.12×105），同種型鑒定為IgG2/κ，IC50分別為29.99 ng/mL，單抗親和常數(shù)Ka為9.1×1010 L/mol，與其他重金

5、屬無交叉反應(yīng)。成功獲得高特異性單克隆抗體。
　　用3B1E5株產(chǎn)生的單抗組裝建立了重金屬汞離子阻斷ELISA檢測試劑盒。用方陣法對(duì)包被濃度、單抗工作濃度、酶工作濃度參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，建立 ELISA檢測方法并建立繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，推導(dǎo)線性回歸方程，確定靈敏度及檢測限，并對(duì)其性能進(jìn)行測定。結(jié)果表明，該試劑盒的靈敏度為12.42 ng/mL，檢測限為4.97 ng/mL，添加回收試驗(yàn)和批內(nèi)批間試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于15％，表明其準(zhǔn)確度和精密度都