三種重金屬單抗的制備與抗體基因序列分析及其免疫檢測方法的建立.pdf

1、重金屬污染事件層出不窮，愈演愈烈，畜禽產(chǎn)品重金屬殘留不同程度超標(biāo)，威脅人畜健康。快速、廉價地監(jiān)測生境中重金屬是減小其對人類及動物危害的先決條件。建立更快速、更經(jīng)濟(jì)的免疫分析法檢測重金屬是生產(chǎn)及經(jīng)濟(jì)發(fā)展的需要。本研究旨在建立能夠穩(wěn)定分泌高親和力和特異性抗重金屬汞、銅和鋅的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，克隆抗重金屬汞、銅和鋅單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因，建立其免疫分析方法并得到初步應(yīng)用。
　　本研究將重金屬（汞、銅和鋅）通過雙功能螯合

2、劑與血藍(lán)蛋白偶聯(lián)制備了免疫抗原，與牛血清白蛋白偶聯(lián)制備了檢測抗原。通過BCA法、紫外分光光度法、SDS-PAGE電泳和石墨爐原子吸收光譜法鑒定重金屬汞、銅和鋅螯合物人工抗原。用合成的免疫抗原免疫BALB/c小鼠，采用雜交瘤技術(shù)建立能穩(wěn)定分泌抗重金屬汞、銅和鋅單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分析雜交瘤細(xì)胞的染色體，鑒定。通過抗體亞型鑒定試劑盒鑒定單克隆抗體的類和亞類，通過體內(nèi)誘導(dǎo)法大量制備并純化抗體，通過間接酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測

3、抗體效價、親和力和細(xì)胞株分泌抗體的穩(wěn)定性，間接競爭 ELISA（IC-ELISA）法測定抗體的特異性。通過提取雜交瘤總RNA、RT-PCR，擴(kuò)增抗體可變區(qū)基因，克隆測序分析該基因。采用矩陣實(shí)驗(yàn)確定抗原抗體的最佳組合，通過對封閉物、pH值、離子強(qiáng)度等影響因子的研究，確定IC-ELISA的最佳工作參數(shù)。研究結(jié)果表明：成功制備了汞、銅和鋅的免疫抗原和檢測抗原，并建立了能穩(wěn)定分泌特異性抗重金屬汞、銅和鋅單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株分別為3G4-G5

4、、9D11-F3和Z1A5，抗體均為IgM亞類，輕鏈為kappa型，親和力達(dá)109L/mol~1010L/mol，半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為1.15μM、0.257μg/mL和0.628μg/mL，與其他金屬的交叉反應(yīng)低。從雜交瘤細(xì)胞3G4-G5、9D11-F3和Z1A5中克隆得到了抗重金屬汞、銅和鋅單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因。在IC-ELISA最佳工作參數(shù)確定的情況下，建立定量測定金屬離子汞、銅和鋅的方法，檢測范圍（IC20

5、～I(xiàn)C80）分別為0.15μM～9.0μM，0.055μg/mL～1.198μg/mL和0.062μg/mL～6.341μg/mL，最低檢測限分別為3.94×10-5mM，0.0227μg/mL和0.015μg/mL。水樣中的汞、銅和鋅添加回收率為分別為88.9％～107.3%，87.4%～106.8%和88.6%～109.4%。
　　本研究成功制備了重金屬汞、銅和鋅抗原，建立了3株能穩(wěn)定分泌高親和力、高特異性抗重金屬汞、銅和鋅單