基于甘草酸和iPA單抗的免疫檢測(cè)技術(shù)及基因工程抗體研究.pdf

1、本研究制備了甘草酸和iPA單克隆抗體，并以單克隆抗體為材料對(duì)免疫學(xué)技術(shù)中(免疫檢測(cè)技術(shù)和基因工程抗體技術(shù))進(jìn)行了研究。主要結(jié)果如下： (1)制備了甘草酸單抗，效價(jià)為2～4×10<'4>，親和常數(shù)為1.00x10<'9>L/mol，抗體為IgGl，輕鏈為к型。以單抗為基礎(chǔ)建立了50％加樣量的icELISA(樣晶占反應(yīng)體系的體積比為50％)，IC50和檢測(cè)范圍分別為1.1 ng/mL和0.2 ng/mL～5.1 ng/mL，比Sha

2、n等建立的基于甘草酸單抗的免疫檢測(cè)方法靈敏度提高了約20倍。 (2)制備了iPA單抗，效價(jià)為1.6～3.2x10<'4>，親和常數(shù)為2.67x10<'9>L/mol，抗體為IgG2a，輕鏈為九型。以單抗為基礎(chǔ)建立了50％(v/v)加樣量的iPA icELISA，IC50和檢測(cè)范圍分別為7.1 ng/mL和 1.7 ng/mL～30.5 ng/mL。 (3)在國(guó)內(nèi)外首次提出了簡(jiǎn)化icELISA，其步驟為：包被，封閉，依次加

3、入游離抗原、酶標(biāo)二抗和抗體，顯色。與常規(guī)icELISA相比，簡(jiǎn)化的icELISA的不同是游離抗原、酶標(biāo)二抗和抗體同時(shí)加入，減少了一個(gè)步驟和一次洗板，檢測(cè)時(shí)間至少減少了30 min。與加樣量相同的常規(guī)icELISA相比，靈敏度提高了1.2～1.4倍。 (4)基于甘草酸和iPA單抗分別建立了簡(jiǎn)化icELISA，甘草酸簡(jiǎn)化icELISA的IC50和檢測(cè)范圍分別是5.3 ng/mL和1.2 ng/mL～23.8 ng/mL，iPA簡(jiǎn)化i

4、cELISA的IC50和檢測(cè)范圍分別是21.2ng/mL和2.8 ng/mL～161.6 ng/mL。與加樣量相同的常規(guī)icELISA相比，甘草酸icELISA的靈敏度提高了1.02倍：iPA icELISA的靈敏度提高了1.4倍。 (5)將膠體金免疫檢測(cè)試紙條應(yīng)用于中草藥真?zhèn)魏推焚|(zhì)鑒定。基于甘草酸單抗建立了甘草酸免疫檢測(cè)試紙條，檢測(cè)極限均為20 ng/mL～50 ng/mL。10 mg甘草樣品用5 mL水提取30 min，直接

5、用試紙條測(cè)定上清液可區(qū)別真?zhèn)胃什荩簧锨逡合♂?00倍，用試紙條可區(qū)分出多年生與一、兩年生栽培甘草根。 (6)對(duì)iPA基岡工程抗體進(jìn)行了研究。從分泌iPA單抗的雜交瘤細(xì)胞中提取了總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到了cDNA。以cDNA為模板克隆了抗體VH和VL基因，通過(guò)SOE-PCR將VH基因、VL基因和linker連接獲得了scFv基因。構(gòu)建了iPA scFv的原核表達(dá)載體，并在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)。構(gòu)建了真核表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化煙草，獲得了有草