免疫檢測(cè)技術(shù)

1、,第九章,免疫檢測(cè)技術(shù),免疫檢測(cè)是目前生物學(xué)檢測(cè)方法中用途最廣泛的一種方法。具有高度精確、靈敏、特異的特點(diǎn)。可用于免疫學(xué)的基礎(chǔ)理論和應(yīng)用研究，也可應(yīng)用于生物學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域。,1 、免疫疾病診斷 2 、動(dòng)物植物生理活動(dòng)研究（激素、維生素） 3 、物種及微生物鑒定 4 、動(dòng)物、植物性狀的免疫標(biāo)記 5 、免疫增強(qiáng)藥物和疫苗的研究 6 、發(fā)病機(jī)理研究 7 、分子生物學(xué)研究,免疫檢測(cè)技術(shù)在生物科學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用

2、：,第一節(jié) 抗原抗體反應(yīng)原理,抗體能特異性地識(shí)別相應(yīng)的抗原，并與之結(jié)合。這種結(jié)合在體外也能發(fā)生，當(dāng)抗原和抗體在體外特異性結(jié)合后可出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)或借助儀器可檢測(cè)出的反應(yīng)現(xiàn)象。 試驗(yàn)時(shí)既可用已知抗體檢測(cè)標(biāo)本中有無(wú)相應(yīng)抗原，也可用已知抗原檢測(cè)標(biāo)本中有無(wú)相應(yīng)抗體。,這種特性就是許多免疫檢測(cè)方法的基礎(chǔ)!!,一、體外抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn),①特異性：抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性。②可逆性：抗原抗體反應(yīng)所形成的復(fù)合物較穩(wěn)定，

3、 但在一定條件下可解離。（低酸、高鹽）③比例性：抗原抗體的比例合適，才可出現(xiàn)可見(jiàn)的 反應(yīng)現(xiàn)象。（網(wǎng)格理論）④階段性：特異性結(jié)合階段和可見(jiàn)反應(yīng)階段。,網(wǎng)格理論——解釋抗原抗體形成沉淀的機(jī)制,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,網(wǎng)格學(xué)說(shuō)（lattice theory）,抗體過(guò)剩,抗原過(guò)剩,抗體抗體比例合適,抗原,,抗體,二、影響抗原抗體反應(yīng)的因素,①溫度：在一定溫度范圍內(nèi)，提

4、高溫度可加速反應(yīng) 速度，縮短反應(yīng)時(shí)間，常用反應(yīng)溫度為37-45℃。②溶液的pH：pH過(guò)高或過(guò)低可改變抗原和抗體理化 性質(zhì)，影響反應(yīng)結(jié)果，因此溶液的pH應(yīng)適宜 （pH 6-8）。③電解質(zhì)：反應(yīng)中必須有適宜的電解質(zhì)（0.85%NaCl） 參與，否則不出現(xiàn)可見(jiàn)反應(yīng)。,三、抗原抗體反應(yīng)類(lèi)型,1.沉淀反應(yīng)2.凝集反應(yīng)3.補(bǔ)體參與的反應(yīng)4.中和反應(yīng)5.免疫標(biāo)記技術(shù),第二節(jié) 常見(jiàn)免疫檢測(cè)方法

5、,可溶性抗原（血清蛋白、病毒抗原、細(xì)胞裂解液或組織液等）與相應(yīng)抗體結(jié)合，在一定條件下形成肉眼可見(jiàn)的沉淀物稱(chēng)沉淀反應(yīng)。,一、免疫沉淀反應(yīng),一、免疫沉淀反應(yīng),1. 液相沉淀反應(yīng),2. 凝膠擴(kuò)散沉淀,3. 凝膠免疫電泳,,絮狀沉淀,環(huán)狀沉淀,免疫濁度沉淀,單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn),,雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn),血清免疫電泳,火箭電泳,對(duì)流免疫電泳,免疫印跡等,,,,,,絮狀沉淀試驗(yàn),操作步驟：（1） 將可溶性抗原作一系列倍比稀釋。（2） 各管加入一定濃度的

6、適量抗血清。（3） 振搖使抗原、抗體充分混勻，置37℃孵育。（4） 產(chǎn)生沉淀量隨抗原量而不同，以出現(xiàn)沉淀物最多的管為最適比例管。 絮狀沉淀試驗(yàn)方法簡(jiǎn)單，設(shè)備要求低，敏感度較低，目前多用以測(cè)定抗原抗體反應(yīng)的最適比。,,環(huán)狀沉淀試驗(yàn),操作步驟：（1） 用毛細(xì)滴管吸取抗血清加于沉淀管（5×50mm）底部，避免產(chǎn)生氣泡。（已知！）（2） 將抗原溶液沿管壁緩緩疊加于抗血清液面上，形成清晰的交界面。（待測(cè)！ ）（3）

7、置沉淀管于室溫下使其反應(yīng)，1~5min內(nèi)在兩界面間呈現(xiàn)乳白色沉淀環(huán)為陽(yáng)性。30min仍無(wú)沉淀環(huán)出現(xiàn)則為陰性。應(yīng)用：主要用于抗原的定性試驗(yàn)。用已知抗體來(lái)檢測(cè)未知抗原。 （診斷炭疽的Ascoli實(shí)驗(yàn)、細(xì)菌分型、血跡鑒定）。,,2. 凝膠擴(kuò)散沉淀,凝膠擴(kuò)散沉淀是指抗原與抗體在凝膠介質(zhì)中自由擴(kuò)散形成濃度梯度，抗原與抗體在比例合適的擴(kuò)散部位相遇形成沉淀線(xiàn)的反應(yīng)。常用的凝膠有瓊脂、瓊脂糖、葡聚糖或聚丙稀酰胺凝膠等。最常用的方法為：

8、 ①單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn) ②雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn),單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn),原 理： 將適當(dāng)濃度的抗體混入瓊脂凝膠中，瓊脂凝固后，打成小孔，加入待測(cè)的抗原物質(zhì)，使抗原在凝膠中由小孔自由向周?chē)鷶U(kuò)散，并在小孔周?chē)线m的位置與抗體結(jié)合形成沉淀環(huán)，沉淀環(huán)的大小與抗原濃度呈正相關(guān)。,單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)示意圖,雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn),雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)是在瓊脂板上按一定距離打數(shù)個(gè)小孔，在相鄰的兩孔內(nèi)分別放入抗原和抗體材料。當(dāng)抗

9、原和抗體向四周凝膠中擴(kuò)散，在兩孔間可出現(xiàn)2～3條沉淀線(xiàn)，本法常用于抗原或抗體的定性或定量檢測(cè)，或用于兩種抗原材料的抗原相關(guān)性分析。,,,,3.免疫電泳技術(shù),免疫電泳技術(shù)是電泳分析與沉淀反應(yīng)的結(jié)合產(chǎn)物。這種技術(shù)有兩大優(yōu)點(diǎn)：一是加快了沉淀反應(yīng)的速度，二是將某些蛋白組分利用其帶電荷的不同而將其分開(kāi)，再分別與抗體反應(yīng)，以此作更細(xì)微的分析。免疫電泳包括:血清免疫電泳、對(duì)流免疫電泳、火箭電泳、免疫印跡等,血清免疫電泳,將抗原混合物

10、（病人血清）在凝膠中用電泳分離后，沿電泳方向挖一平行的小槽，加入抗血清，進(jìn)行雙向擴(kuò)散。沉淀線(xiàn)的特點(diǎn)顯示病人血清與正常人血清存在的差異，即血清蛋白組分的缺少或增加。,免疫電泳原理圖解,火箭免疫電泳,火箭免疫電泳技術(shù)又稱(chēng)作單向電泳擴(kuò)散免疫沉淀試驗(yàn)，它是由單向擴(kuò)散發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)定量技術(shù)，實(shí)質(zhì)上是加速度的單向擴(kuò)散。,,沉淀線(xiàn)的高度與抗原量成正比,火箭電泳圖,二、凝集反應(yīng)（Agglutination）,顆粒性抗原（如細(xì)菌、細(xì)胞）與相

11、應(yīng)抗體，在適當(dāng)電解質(zhì)存在的條件下，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)凝集塊稱(chēng)為凝集反應(yīng)。 1、直接凝集：將細(xì)菌或紅細(xì)胞與相應(yīng)的抗體直接反應(yīng)，出現(xiàn)細(xì)菌凝集或紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。又分為玻片法和試管法。 2、間接凝集：將可溶性抗原包被在紅細(xì)胞或乳膠顆粒表面，與相應(yīng)抗體反應(yīng)出現(xiàn)顆粒凝集現(xiàn)象。,,妊娠免疫診斷試驗(yàn),孕婦尿中，絨毛膜促性腺激素（HCG）含量明顯增高。（HCG是可溶性抗原 ）反之，非孕婦尿中HCG含量甚微，不足以消耗掉抗HCG抗體。

12、,三、補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn),（2個(gè)系統(tǒng)，5種成分）,已知抗原加入血清（檢測(cè)抗體）,加入標(biāo)準(zhǔn)量補(bǔ)體,加入包被抗體的紅細(xì)胞,檢測(cè)紅細(xì)胞溶解情況,Ag,,Ag,,,,,,,,,三、補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn),（2個(gè)系統(tǒng)，5種成分）,免疫標(biāo)記技術(shù)是采用酶、熒光素、放射性核素等標(biāo)記物標(biāo)記抗原或抗體所進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)。免疫標(biāo)記技術(shù)既可對(duì)樣品作定性、定量檢測(cè)，也可進(jìn)行定位分析，且大大提高了方法的靈敏度，是目前應(yīng)用最廣泛的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)。,四、免疫標(biāo)記技術(shù),,常見(jiàn)標(biāo)記免

13、疫技術(shù),放射免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù),四、免疫標(biāo)記技術(shù),該法是用放射性核素作為標(biāo)記物標(biāo)記抗原或抗體所進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)，盡管放射免疫技術(shù)需特殊儀器設(shè)備且有一定的放射性危害，但由于其具有高度的靈敏度（pg）和自動(dòng)化檢測(cè)等特點(diǎn)，因此在實(shí)驗(yàn)研究和臨床檢測(cè)中仍被廣泛應(yīng)用。主要用于激素、小分子藥物、腫瘤標(biāo)志物等小分子化合物的定量分析。,1. 放射免疫技術(shù)（125I）,放射免疫分析－基本原理,競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合反應(yīng)的經(jīng)典標(biāo)記抗

14、原（Ag*）和非標(biāo)記抗原（Ag）與限量抗體(Ab)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Ag*和Ag具有等同的與Ab結(jié)合能力,,,,,放射免疫測(cè)定法(RIA)示意圖,RIA法原理及標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,75,50,30,10,,,,,,0,1,10,100,1000,未標(biāo)記抗原濃度（ng/mL),結(jié)合/未結(jié)合的放射活性（%）,,Ag*-Ab,Ag*,將熒光素（異硫氰酸熒光素或羅丹明等）標(biāo)記抗體，制成熒光抗體診斷試劑。

15、用熒光顯微鏡觀(guān)察熒光的產(chǎn)生或熒光強(qiáng)度，以此判斷抗原的存在、定位和分布情況。免疫熒光技術(shù)有直接法和間接法等。,2. 免疫熒光技術(shù),免疫熒光技術(shù)——直接法,,免疫熒光技術(shù)——間接法,,免 疫 熒 光 染 色 顯 示 細(xì) 胞 骨 架,免疫熒光染色是利用抗原－抗體特異性結(jié)合的原理，用經(jīng)熒光染料標(biāo)記的抗體對(duì)細(xì)胞或組織內(nèi)的蛋白質(zhì)進(jìn)行定性或定量研究的方法。該技術(shù)與熒光顯微鏡觀(guān)察相結(jié)合，可對(duì)特定的蛋白質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞或組織內(nèi)的精確定位。,常用于抗原、抗

16、體標(biāo)記的熒光染料有以下幾種顯示綠色熒光：Fluorescein isothocyancie(FITC),Alexa-488顯示紅色熒光：Rhodamine B, Texas Red, Alexa-546,568,594顯示藍(lán)色熒光：Alexa－350,用Alexa488標(biāo)記的抗人α-tubulin抗體染色顯示微管(綠色); 細(xì)胞核: 紅色, DAPI染色,人皮膚角化細(xì)胞免疫熒光染色,用抗α-tubulin抗體染色顯示微管(綠色);

17、 細(xì)胞核: 紅色, DAPI染色(激光共聚焦顯微鏡照片),PtK1細(xì)胞免疫熒光染色,本法是抗原抗體反應(yīng)的特異性與酶對(duì)底物的高效催化活性相結(jié)合的免疫檢測(cè)技術(shù)。酶標(biāo)記的抗原或抗體與待檢標(biāo)本中的相應(yīng)成分特異性結(jié)合，根據(jù)酶作用底物后的顏色變化，采用肉眼或酶標(biāo)檢測(cè)儀分析、判斷結(jié)果。常用方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和酶免疫組化法，前者用于檢測(cè)可溶性抗原或抗體，后者常用于檢測(cè)組織中或細(xì)胞表面的抗原。,3. 免疫酶測(cè)定法,是在固相載體（通常為

18、聚苯乙烯反應(yīng)板）表面進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)中常用的酶是辣根過(guò)氧化物酶（HRP），底物為二苯基聯(lián)苯胺。,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）：,ELISA試驗(yàn)三個(gè)必要的試劑,(1)固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）(2)酶標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物）(3)酶作用的底物（顯色劑）,,底物顯色定性或定量的分析,原理,包被,反應(yīng)加入待測(cè)抗體或抗原和酶標(biāo)抗原或抗體,洗滌使結(jié)合在固相上的抗原抗體復(fù)合物與未結(jié)合的分離,1,2,3,4,基

19、本步驟,五種常見(jiàn)的檢測(cè)方法,1 雙抗夾心法（測(cè)定抗原）2 測(cè)定抗體的間接法3 競(jìng)爭(zhēng)法（測(cè)定抗原）4 捕獲包被法測(cè)IgM抗體 5 ABS-ELISA法,適用于測(cè)定二價(jià)或二價(jià)以上的大分子抗原，但不適用于測(cè)定半抗原及低于二價(jià)的小分子單價(jià)抗原，因其不能形成兩位點(diǎn)夾心,,1 雙抗夾心法測(cè)抗原,,2 間接法測(cè)抗體,幾種標(biāo)記/檢測(cè)技術(shù)靈敏度的比較,酶標(biāo),熒光,放免,發(fā)光,靈敏度(mol/L),10-1810-1510-12

20、10-9,幾種標(biāo)記/檢測(cè)試劑的有效期比較,酶標(biāo),熒光,放免,發(fā)光,有效期（月）,1815129630,人民幣,,,人民幣,三種免疫測(cè)定技術(shù)的成本及費(fèi)用,,三種免疫測(cè)定技術(shù)的成本及費(fèi)用,,放免,酶標(biāo),發(fā)光,A. 將Ab吸附在固相載體表面; B. 加入酶標(biāo)Ag和待測(cè)Ag，競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合Ab； 對(duì)照只加入酶標(biāo)Ag； C. 加底物。對(duì)照孔與樣品孔底物降解量的差＝未知Ag量。,3 競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定抗原,血清標(biāo)本中的I

21、gM包括針對(duì)抗原的特異性IgM抗體和非特異性的IgM 加入特異性抗原試劑：它只與固相上的特異性IgM結(jié)合 抗人IgM抗體包被 加入血清標(biāo)本 加入特異性抗原試劑 加入針對(duì)特異性抗原的酶標(biāo)抗體 加底物顯色,,,,,4 捕獲包被法測(cè)IgM抗體,捕獲法,原理：抗人IgMμ鏈抗體包被捕獲待測(cè)標(biāo)本中IgM類(lèi)抗體加入特異性抗原和酶標(biāo)記特異性抗原的抗體 底物顯色,,,,ABS為親和素(avi

22、din)生物素(biotin)系統(tǒng)(system)的略語(yǔ)。親和素是一種糖蛋白，生物素為小分子化合物。親和素與生物素的結(jié)合，雖不屬免疫反應(yīng)，但特異性強(qiáng)，親和力大，兩者一經(jīng)結(jié)合就極為穩(wěn)定。 1個(gè)親和素分子可與4個(gè)生物素分子結(jié)合。因此把親和素和生物素與ELISA偶聯(lián)起來(lái)，就可提高ELISA的敏感度。,5 ABS-ELISA法,ABS-ELISA法,①：固相支持物；②：樣品；③：特異性IgG；④：生物素化抗小鼠IgG （Bi