復(fù)方甘草酸苷片的研制及體外代謝研究.pdf

1、復(fù)方甘草酸苷片(compound glycyrrhizin tablets)是由甘草酸單銨鹽(glycyrrhizin，GL)，甘氨酸(glycine，GLY)，DL-蛋氨酸(DL-methionine，MET)組方的復(fù)方制劑，療效確切，臨床應(yīng)用廣泛，在肝病領(lǐng)域主要用于治療慢性肝病，改善肝功能，在非肝病領(lǐng)域用于過敏性反應(yīng)(如皮疹、蕁麻疹、藥物疹)、小兒異位性皮炎、扁平苔蘚、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腎綜合征出血熱及傳染性非典型肺炎(SAS)等。本

2、課題臨床前研究已完成復(fù)方甘草酸苷片的處方工藝研究，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，穩(wěn)定性考察及家兔體內(nèi)生物等效性評價等工作，并獲得國家食品藥品監(jiān)督管理局的臨床批件(批件號：2006L01472)。在此基礎(chǔ)上，擬進行復(fù)方甘草酸苷片工業(yè)化生產(chǎn)的處方工藝優(yōu)化和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)修訂，試生產(chǎn)和質(zhì)量評價，人體生物等效性評價，以及GL的體外代謝研究等。以期通過本復(fù)方制劑的開發(fā)成功，為慢性肝炎的臨床治療提供國產(chǎn)新制劑：同時，從代謝途徑研究復(fù)方制劑減毒增效的作用機理，為GL的體內(nèi)

3、代謝研究和臨床安全用藥評價奠定實驗基礎(chǔ)。 第一部分、復(fù)方甘草酸苷片工業(yè)化生產(chǎn)的處方工藝參數(shù)優(yōu)化和質(zhì)量評價。首次建立了在同一色譜條件下檢測三個成分的含量，溶出度和有關(guān)物質(zhì)的HPLC法(PDA檢測器)，該法簡便、靈敏、專屬性強，重復(fù)性好，可將各破壞條件下的降解產(chǎn)物與主成分峰完全分離；優(yōu)化了復(fù)方甘草酸苷片工業(yè)化生產(chǎn)的處方工藝參數(shù)，完成了試生產(chǎn)：深入進行了有關(guān)物質(zhì)研究，三批試生產(chǎn)產(chǎn)品中的有關(guān)物質(zhì)與原料藥，加速試驗放置6個月樣品以及市售產(chǎn)

4、品美能進行對比，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，均有P>0.05，說明制劑過程中和加速放置6個月過程中沒有使藥物間、藥物與輔料間產(chǎn)生明顯的未知物，與美能相比也未增加新的有關(guān)物質(zhì)，為有關(guān)物質(zhì)限度的確定提供了翔實的依據(jù)；按臨床批件要求和2005版《中國藥典》規(guī)范修訂質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，與日本進口產(chǎn)品美能(Stronger Neo-minophagen C，SNMC)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)相比，分析方法更具先進性和可靠性，提升了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，可有效控制復(fù)方甘草酸苷片的質(zhì)量；對試生產(chǎn)產(chǎn)品

5、進行了質(zhì)量評價和穩(wěn)定性考察，結(jié)果表明，復(fù)方甘草酸苷片工業(yè)化生產(chǎn)的處方合理，工藝穩(wěn)定。 第二部分、按草酸苷片在健康人體的生物等效性。采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC/MS/MS)測定血漿中GL的代謝產(chǎn)物甘草次酸(Glycyrrhctinic Acid；GA)的濃度，美能為參比制劑，22名健康男性受試者自身交叉單劑量口服治療劑量試驗制劑與參比制劑，血漿樣品經(jīng)液-液萃取，內(nèi)標(biāo)為人參皂苷Rh2，經(jīng)方法確證表明建立的檢測方法快速，靈敏、重現(xiàn)

6、性好、專屬性強，內(nèi)源性物質(zhì)不干擾待測物的測定，樣品前處理簡便。采用DAS2.0藥動學(xué)統(tǒng)計軟件計算藥動學(xué)參數(shù)，受試制劑和參比制劑的主要藥動學(xué)參數(shù)為：AUC0-∞=分別為(5794±3129)ng·h·ml-1和(5621±2752)ng·h·ml-1，AUC0-t分別為(5084±2191)ng·h·ml-1和(5187±2367)ng·h·ml-1，Cmax分別為(288±249)ng·ml-1和(287±160)ng·ml-1，tma

7、x分別為(13.5±6.0)h和(16.7±7.2)h，t1/2分別為(13.1±8.5)h和(10.34±5.65)h，受試制劑相對生物利用度為(95.84±20.8)％。主要藥動學(xué)參數(shù)AUC0-∞、AUC0-t、Cmax對數(shù)轉(zhuǎn)換后進行方差分析，雙單側(cè)t檢驗和(1-2α)置信區(qū)間法進行生物等效性評價，其中tmax采用非參數(shù)檢驗法，結(jié)果均顯示試驗制劑與參比制劑間無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，試驗制劑與參比制劑AUC0-t，Cmax比值的

8、90％可信區(qū)間分別為85.4％～122.3％，80.9％～106.0％，均在AUC0-t，Cmax90％可信區(qū)間的80％～125％，70～143％范圍之內(nèi)。結(jié)果表明試驗制劑與參比制劑具有人體生物等效性。 第三部分、GL和GA在大鼠肝微粒體的體外代謝研究。 本文建立了Sprague-Dawley大鼠肝微粒體體外代謝模型，苯巴比妥為誘導(dǎo)劑，按80mg·kg-1劑量腹腔注射3天，超速離心法制備肝微粒體，Bradford法測定蛋

9、白濃度，分別以Phenacetin，Clivorinc，Propofol作為探針底物進行肝微粒體的CYP450酶，酯酶和肝微粒體Ⅱ相酶(UGT)的活性表征，證實了肝微粒體代謝模型和酶活性的有效性；本文首次建立了超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(UPLC/MS)同時測定GL，GA及其代謝產(chǎn)物，該法快速，靈敏、重現(xiàn)性好、專屬性強，并通過質(zhì)譜峰對代謝產(chǎn)物峰進行了定性和結(jié)構(gòu)推證；在肝微粒體CYP450酶，酯酶和肝微粒體Ⅱ相酶(UGT)孵育體系中以G

10、L為底物進行溫孵，沒有檢測到3-單葡萄糖醛酸甘草次酸(18β-glyeyrrheticacid-3-O-β-D-monoglucuronide，GAMG)或其它任何代謝產(chǎn)物，即β-NADPH，UDPGA對GL代謝沒有催化作用，該結(jié)果首次提供了CYP450酶，酯酶和肝微粒體Ⅱ相酶(UGT)對GL無代謝的直接證據(jù)，國內(nèi)外未見報道；在肝微粒體酯酶孵育體系中以GA為底物進行溫孵，發(fā)現(xiàn)酯酶對GA無代謝：在肝微粒體CYP450酶孵育體系中以GA為底

11、物進行溫孵，檢測到GA的五個羥化代謝產(chǎn)物(M1，M2，M3，M4，M5，m/z487，485)和一個未知代謝產(chǎn)物(M6，m/z501)，NADPH對GA的代謝有催化作用，為NADPH依賴性的氧化代謝機理，該結(jié)果發(fā)現(xiàn)了在CYP450酶孵育體系中GA代謝生成M1，M2，M3，M4，M5，M6的代謝途徑，比現(xiàn)有文獻(xiàn)報道的兩個羥化代謝產(chǎn)物有更深入的發(fā)現(xiàn)；在大鼠肝微粒體Ⅱ相酶(UGT)孵育體系中以GA為底物進行溫孵，發(fā)現(xiàn)GA與葡萄糖醛酸結(jié)合后生成

12、GAMG和GL，即UGPDA對GA的代謝有催化作用，為UGPDA依賴性的代謝機理，首次發(fā)現(xiàn)GA在大鼠肝微粒體溫孵體系中與葡萄糖醛酸結(jié)合，此現(xiàn)象國內(nèi)外尚未見報道；同時，在研究中還觀察到UGT能使GA經(jīng)過CYP450代謝的代謝產(chǎn)物進行Ⅱ相酶代謝，產(chǎn)生3個結(jié)合產(chǎn)物M1'，M2'，M3'(m/z664)的新代謝途徑；在肝微粒體孵育體系中加CYP450酶化學(xué)抑制劑以鑒定參與GA代謝的CYP450亞酶，選擇在藥物代謝中起主要作用的CYP1A2(Fu

13、rafilline)、CYP3A4(Ketoeonazole)、CYP2C19(Tielopidine)、CYP2D6(Quinidin)、CYP2E(4-Methlpyrazole)五種CYP450亞酶和黃素單氧化酶(FMO，Methimazole)為研究對象，本研究發(fā)現(xiàn)，GA的代謝主要由CYP3A參與，對M1，M2，M3，M4和M6的生成均有明顯影響，代謝產(chǎn)物的抑制與Ketoconazole呈劑量依賴性，比現(xiàn)有文獻(xiàn)報道的CYP3A1

14、/2只參與了GA的C-22α羥化代謝，有更深入的發(fā)現(xiàn)，同時，首次觀察到FMO參與了GA的部分羥化代謝(M1，M2，M3)，而CYP1A2、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1對GA的代謝沒有影響；在大鼠肝微粒體CYP450孵育體系中以各拆方組作為底物進行孵育，考察對GA代謝的影響，發(fā)現(xiàn)GLY增加了GA的轉(zhuǎn)化，同時，羥化產(chǎn)物M1，M2，M3的生成量減少，未知代謝產(chǎn)物M6的生成量增加，而GLY，MET與GA共同孵育時對GA的轉(zhuǎn)化和羥化

15、代謝物的生成影響不大；在大鼠肝微粒體Ⅱ相酶(UGT)孵育體系中以各拆方組作為底物進行孵育，考察對GA代謝的影響，各拆方組均發(fā)現(xiàn)GA的剩余量以及GAMG和GL的生成量增加的現(xiàn)象，其中，GLY，MET與GA共同孵育時可使GA的剩余量增加約90％，即活性產(chǎn)物量的增加，推測對GA有一定的增效作用，GAMG和GL的生成量增加約30％，對代謝產(chǎn)物的排泄可能有促進作用。本文進行了復(fù)方甘草酸苷片工業(yè)化生產(chǎn)的處方工藝優(yōu)化和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)修訂，完成了試生產(chǎn)及其質(zhì)