萊克多巴胺、氯霉素、三聚氰胺藥物殘留的酶聯(lián)免疫檢測法的建立.pdf

1、隨著食品貿(mào)易國際化的發(fā)展，人們對(duì)動(dòng)物源性食品的需求量大大增加，因而畜牧養(yǎng)殖業(yè)得到了迅速發(fā)展。但是，由于科學(xué)知識(shí)的缺乏和經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使，在養(yǎng)殖業(yè)中超標(biāo)使用藥物和濫用違禁藥物的現(xiàn)象普遍存在，在我國情況尤為嚴(yán)重。近幾年，我國食品出口因藥物殘留問題被許多國家退貨或者銷毀，給我國造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]，嚴(yán)重?fù)p害了我國食品的質(zhì)量形象。藥物殘留不僅直接對(duì)人體產(chǎn)生急、慢性毒性作用，引起細(xì)菌耐藥性的增加，還通過環(huán)境和食物鏈的作用間接對(duì)人體健康造成潛在

2、威脅；藥物殘留對(duì)人體的影響主要表現(xiàn)在變態(tài)反應(yīng)和過敏反應(yīng)、致畸、致突變和致癌作用等方面[2-5]。動(dòng)物源性食品中違禁藥物的殘留問題也越來越成為全世界共同關(guān)注的公共衛(wèi)生問題。
　　 做好食品安全工作不僅是保障人類健康，促進(jìn)畜牧業(yè)發(fā)展和我國對(duì)外貿(mào)易的需要，也是國家政治經(jīng)濟(jì)穩(wěn)定的需要。控制動(dòng)物源性食品中藥物殘留已經(jīng)成為目前確保動(dòng)物源性食品安全的一項(xiàng)重要措施，許多經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)國家十分重視藥物殘留監(jiān)控，頒布了-系列畜產(chǎn)品藥物殘留管理法規(guī)，制定了

3、詳盡的藥物殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，嚴(yán)格實(shí)施對(duì)畜產(chǎn)品藥物殘留的監(jiān)控、監(jiān)督與檢測[6-8]。近年來，我國也高度重視這-問題，為了有效地控制動(dòng)物源性產(chǎn)品中的藥物殘留，制定了嚴(yán)格的殘留標(biāo)準(zhǔn)和休藥期以限制違禁藥物在食品中的殘留，采取法律、經(jīng)濟(jì)、行政和技術(shù)手段實(shí)行監(jiān)控[9，10]，并借鑒國外先進(jìn)經(jīng)驗(yàn)和技術(shù)，結(jié)合我國國情，研究、篩選出一套可行的違禁藥物在食品中的殘留檢測方法。
　　 目前國內(nèi)外采用的殘留分析檢測方法主要有理化檢測法（包括HPLC、LC-

4、MS、LC-MS/MS等儀器法）、微生物檢測法、免疫檢測法(包括ELISA、RIA、EIA、FIA、MAIA)等。理化檢測法準(zhǔn)確、穩(wěn)定、可靠，可以作為標(biāo)準(zhǔn)方法，但儀器設(shè)備昂貴，樣品前處理復(fù)雜，費(fèi)時(shí)，費(fèi)力，不易普及：微生物檢測法往往會(huì)高出最高檢測量(MRLs)，靈敏度不高。因此必須建立快速、靈敏、有效的檢測方法。免疫檢測法中的酶聯(lián)免疫檢測法（包括ELISA、CL-ELISA、MAIA等）克服了以上方法的缺點(diǎn)，是一種快速、靈敏、方便、易普及

5、的檢測方法，有著廣闊的發(fā)展前景。本論文旨在建立萊克多巴胺的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測法(CL-ELISA)、氯霉素的磁分離酶聯(lián)免疫檢測法(MAIA)和三聚氰胺的酶聯(lián)免疫檢測法(ELISA)。
　　 在對(duì)萊克多巴胺的研究中，首先根據(jù)其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，利用對(duì)氨基苯甲酸法合成了免疫原(Rac-cBSA)，將此免疫原免疫新西蘭大白兔制得萊克多巴胺的多克隆抗體，合成免疫原的同時(shí)，我們用BDE法合成了包被抗原(Rat-OVA)。然后利用間接CL-ELI

6、SA研究萊克多巴胺抗體的親和度、靈敏度、交叉反應(yīng)及在牛奶中萊克多巴胺回收率的測定。經(jīng)檢測，IC50是0.45ppb，檢測限為0.001ppb，線性范圍為0.01-10ppb;該抗體對(duì)其它β-興奮劑交叉反應(yīng)率很?。蝗R克多巴胺在牛奶中的添加回收率在78-120％之間，批內(nèi)變異系數(shù)低于18.1％，批間變異系數(shù)低于24.7％。
　　 在對(duì)氯霉素的研究中，通過直接MAIA法測得氯霉素單克隆抗體的親和度、靈敏度、交叉反應(yīng)及在牛奶中氯霉素回收

7、率的測定。經(jīng)檢測，氯霉素抗體的IC50是0.05ppb，線性范圍為0.005-5ppb;該抗體僅對(duì)琥珀氯霉素有交叉反應(yīng)（交叉反應(yīng)率為6.25％），對(duì)其它的酰胺醇類抗生素的交叉反應(yīng)率很?。粰z測氯霉素在牛奶中的添加回收率在85.2-113.7％之間，變異系數(shù)在9.9-22％之間。
　　 在對(duì)三聚氰胺的研究中，首先根據(jù)其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，利用水溶性碳二亞胺法合成了免疫原(MEL-TG)，將此免疫原免疫小鼠，經(jīng)過細(xì)胞融合與克隆化得到三聚氰胺的單

8、克隆抗體，合成免疫原的同時(shí)，我們用同樣的方法合成了包被抗原(MEL-BSA)。然后利用間接ELISA法研究了三聚氰胺抗體的靈敏度、交叉反應(yīng)及在牛奶中三聚氰胺回收率的測定。經(jīng)檢測，IC50是22.6ppb，檢測限為5.0ppb，線性范圍為5.0-405ppb;該抗體對(duì)其它類似物交叉反應(yīng)率很小：三聚氰胺在牛奶中的添加回收率在70-125％之間，批內(nèi)變異系數(shù)低于12.0％，批間變異系數(shù)低于13.0％。
　　 通過本課題的研究，成功制備