核酸檢測(cè)技術(shù)

1、第2章核酸檢測(cè)技術(shù),核酸檢測(cè)技術(shù)直接對(duì)動(dòng)植物有害生物基因序列和結(jié)構(gòu)進(jìn)行測(cè)定。核酸的分離純化PCR技術(shù)核酸雜交技術(shù),第1節(jié)核酸的分離純化,核酸的分離純化的原則,保持核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性提高核酸制品的純度,技術(shù)路線的設(shè)計(jì),破碎細(xì)胞的方法,,機(jī)械 （勻漿、超聲破、研磨等）,非機(jī)械（化學(xué)處理、生化法）,沉淀是濃縮核酸最常用且高效的方法。,核酸濃度檢測(cè)與完整性測(cè)定方法,濃度測(cè)定 紫外分光光度法

2、 260nm 熒光光度法 EB熒光,完整性測(cè)定瓊脂糖凝膠電泳法：以EB為示蹤劑的核酸凝膠電泳結(jié)果為依據(jù)?；蚪MDNA片段如發(fā)生降解，電泳圖呈拖尾狀；完整的或降解很少的總RNA電泳圖譜中，三條帶的熒光強(qiáng)度積分應(yīng)呈特定的比值,問題一：DNA樣品不純 抑制后續(xù)酶解和PCR反應(yīng),DNA提取常見問題,DNA提取常見問題,問題二： DNA降解,DNA提取常見問

3、題,問題三： DNA提取量少,真菌,昆蟲,,,第2節(jié)PCR擴(kuò)增技術(shù),PCR, a ‘DNA photocopier’,,PCR技術(shù)簡(jiǎn)史,DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明,,,1985年，美國(guó)PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）最初采用E-coli DNA聚合酶進(jìn)行PCR，由于該酶不耐熱，使這一過程耗時(shí)，費(fèi)力，且易出錯(cuò)耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使得PCR能高效率的進(jìn)行，隨后PE-Cetu

4、s公司推出了第一臺(tái)PCR自動(dòng)化熱循環(huán)儀1993年，Mullis等因此項(xiàng)技術(shù)獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng),,PCR技術(shù)簡(jiǎn)史,DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明,,,Kary B. Mullis（1944－）,http://www.karymullis.com,1989年美國(guó)《Science》雜志列PCR 為十余項(xiàng)重大科學(xué)發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。,1. PCR的基礎(chǔ),,Poly

5、merase,Chain,Reaction,PCR,,The only enzyme used in this reaction is DNA polymerase.,,Polymerase,Chain,Reaction,,The products of the first reaction become substrates of the following one, and so on.,PCR,,Polymerase,Chain,

6、Reaction,,PCR,Components：Thermostable DNA Polymerase， Target DNA，Pair of Primers， dNTPs， Mg++ ions， Buffer solution,Denaturation：The target DNA (template) is separated into two stands by heating to 95℃Primer annealing

7、: The temperature is reduced to around 55℃ to allow the primers to anneal.Polymerization (elongation, extension): The temperature is increased to 72℃ for optimal polymerization step which uses up dNTPs and required Mg2+

8、.,The PCR cycle:Three different steps in each PCR cycle,PCR的擴(kuò)增？,How does PCR work,How does PCR work,The third cycle,The fourth cycle,2. PCR的類型,多重PCR（multiplex PCR）巢式PCR（nested PCR）定量PCR（quantitative PCR）不對(duì)稱PCR（asymme

9、tric PCR）反向PCR（inverse PCR）逆轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription PCR）Overlap PCR … …,PCR using several primer pairs SIMULTANEOUSLYTypically generates a product band for each primer pair,多重PCR（multiplex PCR）:What,2.1 多重PCR（mu

10、ltiplex PCR）,Multiplex PCR: Why,Detect several genes at onceeg. transgenic plant screenInternal controlsVERY importantTells you how well the PCR reaction workedReduces “false negatives”Reduces “false positives”,多重

11、PCR（multiplex PCR）,Multiplex PCR: How,Same as regular PCRCare in primer designMuch greater chance of primer-dimersMuch greater chance of artifactsAnnealing temperatures must be close,多重PCR（multiplex PCR）,A Typical M

12、ultiplex PCR Reaction,Sterile Water 34.0 ul10X PCR Buffer 5.0 ulMgCl2 (50mM) 2.5 uldNTP’s (10mM each) 1.0 ul Primer1FWD 1.0 ul Primer1REV 1.0 ul Primer2FWD

13、 1.0 ul Primer2REV 1.0 ul Primer3FWD 1.0 ul Primer3REV 1.0 ulDNA Polymerase 0.5 ulDNA Template 1.0 ulTotal Volume 50.0 ul,多重PCR（multiplex PCR）,Multip

14、lex PCR: Example,Three primer pairsControl, resistance, and trait genesControl gene fragment is largest and (almost) faintestTrait gene is smallest and brightest,,,,Resistance Gene,Trait Gene,Control Gene,Primers,,多重

15、PCR（multiplex PCR）,Multiplex PCR: Example,Three primer pairs,,,,Resistance Gene,Trait Gene,Which are transgenic?,Control Gene,Primers,,多重PCR（multiplex PCR）,Nested Multiplex PCR,,,,2nd Stage PCR,Dilute 100 foldBetween 1

16、st & 2nd stage reactions,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,1F,1R,2R,3R,5R,6R,,,,3F,2F,,,6F,4F,5F,4R,Primary Multiplex RT-PCR,,,,,,,,多重PCR（multiplex PCR）,2.2 定量PCR（quantitative PCR）,實(shí)時(shí)熒光定量PCR （Real time Quantitative PCR）：在

17、PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析的方法。Real-time PCR monitors the fluorescence emitted during the reaction as an indicator of amplicon production at each PCR cycle (in real time) as opposed to the endpoint

18、 detection,熒光定量PCR技術(shù)：利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的關(guān)系對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析。,與常規(guī) PCR技術(shù)比較：對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析，無法對(duì)起始模板準(zhǔn)確定量，無法對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測(cè),（1）定量原理,三個(gè)概念： 擴(kuò)增曲線、熒光閾值、Ct值,如何對(duì)起始模板定量？,通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析,熒光定量PCR原理

19、——擴(kuò)增曲線,,擴(kuò)增曲線圖：橫坐標(biāo)：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（Cycle）；縱坐標(biāo)：熒光強(qiáng)度 每個(gè)循環(huán)進(jìn)行一次熒光信號(hào)的收集,,熒光檢測(cè)元件,熒光擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：基線期、指數(shù)增長(zhǎng)期和平臺(tái)期。,Cycle（循環(huán)數(shù)）,Rn（熒光強(qiáng)度）,熒光定量PCR原理——熒光域值,Cycle（循環(huán)數(shù)）,Rn（熒光強(qiáng)度）,,,基線期,,指數(shù)擴(kuò)增期,,平臺(tái)期,熒光域值,手動(dòng)設(shè)置：大于熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光最高值；進(jìn)入指數(shù)期的最初階段,熒光定量P

20、CR原理——Ct值,PCR擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)。,縱軸：熒光信號(hào)量,Ct值的特點(diǎn)：相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增，終點(diǎn)處產(chǎn)物量不恒定； Ct值則極具重現(xiàn)性,,Ct值的重現(xiàn)性,定量原理,,理想的PCR反應(yīng)： X=X0*2n非理想的PCR反應(yīng)： X=X0 (1+Ex)n n：擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)

21、 X：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量 X0：初始模板量 Ex：擴(kuò)增效率,擴(kuò)增效率 E（amplification efficiency）一個(gè)循環(huán)后的產(chǎn)物增加量與這個(gè)循環(huán)的模板量的比值，其值位于0到1之間。在PCR的前20或30個(gè)循環(huán)中，E值比較恒定，為指數(shù)擴(kuò)增期，隨后E值逐步降低，直至0，此時(shí)PCR達(dá)到平臺(tái)期，不再擴(kuò)增。擴(kuò)增效率的計(jì)算可以采用系列稀釋法，將稀釋后濃度的對(duì)數(shù)值與所得Ct值做圖，在一定范圍內(nèi)應(yīng)該是得到一條

22、直線，利用公式（1）：E=10-1/K-1（K為該直線斜率）即可計(jì)算出E值。,在擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到閾值線時(shí): XCt=X0 (1+Ex)Ct =M (1) XCt:熒光擴(kuò)增信號(hào)達(dá)到閾值強(qiáng)度時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的量. 在閾值線設(shè)定以后,它是一個(gè)常數(shù),我們?cè)O(shè)為M方程式(1)兩邊同時(shí)取對(duì)數(shù)得: log M=log X0 (1+Ex)Ct (2)整理方程

23、式(2)得: log X0= - log(1+Ex) *Ct+ log M (3) CT = - k lg X0+ b （線性方程）LogX0濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)即Ct值就可計(jì)算出樣品中所含的模板量。,標(biāo)準(zhǔn)曲線：CT值對(duì)[DNA]0作圖,模板DNA量越多，熒光達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小。 Log模板起始濃度與Ct值呈線性關(guān)系。,（2）熒光定量PCR

24、的化學(xué)原理,1. Hydrolysis probes （水解探針）(TaqMan, Beacons) 2. DNA-binding (intercalating) agents （結(jié)合）(SYBR Green, Eva Green, LC Green)3. Hybridization or FRET probes （雜交）(Light Cycler),非特異性熒光標(biāo)記： 1、 SYBR Green

25、 特異性熒光標(biāo)記： 2、TaqMan 3、Molecular Beacon 4、Amplisensor,DNA產(chǎn)物的熒光標(biāo)記,SYBR Green 法,SYBR Green 能結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位,SYBR Green 只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光 變性時(shí)，DNA雙鏈分開，無熒光 復(fù)性和延伸時(shí)，形成雙鏈DNA， SYBR G

26、reen 發(fā)熒光，在此階段采集熒光信號(hào)。 信號(hào)強(qiáng)度與DNA分子總數(shù)目成正比。,,SYBR Green,,,,SYBR Green 法優(yōu)缺點(diǎn),Tm值：DNA解鏈一半時(shí)的溫度,將溫度與熒光強(qiáng)度的變化求導(dǎo)。(-dI/dT),,TaqMan法,TaqMan---水解型雜交探針,5′端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán) (Quencher, Q) 探針完整，R所發(fā)射的熒光能量被Q基

27、團(tuán)吸收 ，無熒光， R與Q分開，發(fā)熒光 Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探針,每擴(kuò)增一條DNA分子，釋放一個(gè)熒光信號(hào)，可以在循環(huán)過程中任一點(diǎn)檢測(cè)熒光,TaqMan法優(yōu)缺點(diǎn),Published Items in Each Year,Examples of SYBR Green real-time PCR assays for detection of plant pathogenic fungi (last 6 year

28、s),,（3）定量方法,絕對(duì)定量（Absolute Quantification）確定未知樣本中某個(gè)核酸序列的絕對(duì)量值，即通常所說的拷貝數(shù)。 相對(duì)定量（Relative Quantification） 測(cè)定一個(gè)測(cè)試樣本中目標(biāo)核酸序列與校正樣本中同一序列表達(dá)的相對(duì)變化。 2-△C（t） 雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法,,相對(duì)定量中的內(nèi)標(biāo) 內(nèi)標(biāo)通常是β-actin、GAPDH基因等看家基因 在細(xì)胞中的表達(dá)量或在基因組中的拷貝數(shù)恒定，受環(huán)境因

29、素影響小內(nèi)標(biāo)定量結(jié)果代表了樣本中所含細(xì)胞或基因組數(shù)量,絕對(duì)定量的標(biāo)準(zhǔn)樣品： 已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒DNA和體外轉(zhuǎn)入的RNA,相對(duì)定量：參照因子Calibrator,相對(duì)定量分析方法1 -ΔΔCt,相對(duì)定量分析方法2：雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法目標(biāo)基因與內(nèi)參基因擴(kuò)增效率不同,特異性 重復(fù)性 靈敏度其他問題,常見問題討論,擴(kuò)增的特異性,引物？,Tm，重新設(shè)計(jì)引物，優(yōu)化條件,Tm,重復(fù)性---判斷實(shí)驗(yàn)優(yōu)劣的重要指標(biāo),判斷指標(biāo)：主要為標(biāo)準(zhǔn)差（

30、SD）和變異系數(shù)（CV）影響重復(fù)性的因素：PCR 反應(yīng)擴(kuò)增的效率：優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，使反應(yīng)體系達(dá)到最佳擴(kuò)增效率 。目的基因的初始濃度： 使用初始濃度具有較高數(shù)量級(jí)的樣本或作平行孔。標(biāo)準(zhǔn)曲線的影響：不少于5個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品，涵蓋待測(cè)樣本中目的基因量可能出現(xiàn)的全部濃度范圍；理想的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)與樣本具有高同源性，質(zhì)粒DNA 或是體外合成、轉(zhuǎn)錄的RNA。,影響靈敏度的因素,反應(yīng)體系中形成的引物二聚體的影響 可以用水解探針代替SYBR Gre

31、en I，有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)使用水解探針的敏感性要比SYBR Green I高出10倍?？梢允褂脽釂?dòng)辦法或使用特殊處理的Taq酶要盡可能地優(yōu)化引物設(shè)計(jì)如果反應(yīng)體系中出現(xiàn)PCR的抑制因素，應(yīng)適當(dāng)將目的基因的濃度稀釋后再進(jìn)行擴(kuò)增。注意避免室溫混合各種試劑，并且在一經(jīng)混合后立即開始進(jìn)行擴(kuò)增。 循環(huán)數(shù) Mg2＋的濃度,Q1:無Ct值（信號(hào)）出現(xiàn),可能性不大,檢測(cè)熒光信號(hào)的步驟有誤: 一般SG法采用72℃延伸時(shí)采集，Taqman法則一般在退

32、火結(jié)束時(shí)或延伸結(jié)束采集信號(hào)。引物或探針降解: 可通過PAGE電泳檢測(cè)其完整性。模板量不足: 對(duì)未知濃度的樣品應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起。模板降解: 避免樣品制備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況。,Q2:Ct值出現(xiàn)過晚（Ct＞38）,擴(kuò)增效率低: 反應(yīng)條件不夠優(yōu)化。設(shè)計(jì)更好的引物或探針；改用三步法進(jìn)行反應(yīng)；適當(dāng)降低退火溫度；增加鎂離子濃度等。PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足。PCR產(chǎn)物太長(zhǎng): 一般采用80-150

33、bp的產(chǎn)物長(zhǎng)度。,Q3:標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系不佳,加樣存在誤差: 使得標(biāo)準(zhǔn)品不呈梯度。標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)降解: 應(yīng)避免標(biāo)準(zhǔn)品反復(fù)凍融，或重新制備并稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。引物或探針不佳: 重新設(shè)計(jì)更好的引物和探針模板中存在抑制物，或模板濃度過高。,Q4:陰性對(duì)照也出現(xiàn)明顯的起飛,反應(yīng)mix或水被污染。引物二聚體的出現(xiàn)： 用SG法在35cycles以后陰性出現(xiàn)起飛屬正常情況，可配合熔解曲線進(jìn)行分析。反應(yīng)過程中探針的降解：用PAGE電泳對(duì)探針進(jìn)行

34、檢測(cè)。ROX校正的問題：如果使用了，則可能是ROX的降解所造成。,Q5:熔解曲線不止一個(gè)主峰,引物設(shè)計(jì)不夠優(yōu)化：應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。引物濃度不佳：適當(dāng)降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比。鎂離子濃度過高：適當(dāng)降低鎂離子濃度，或選擇更合適的mix試劑盒。模板有基因組的污染：RNA提取過程中避免基因組DNA的引入，或通過引物設(shè)計(jì)避免非特異擴(kuò)增。,Q6:擴(kuò)增效率低,反應(yīng)試劑中部分成分特別是熒光染料降解。反應(yīng)條件不

35、夠優(yōu)化：可適當(dāng)降低退火溫度或改為三步擴(kuò)增法。反應(yīng)體系中有PCR反應(yīng)抑制物：一般是加入模板時(shí)所引入，應(yīng)先把模板適度稀釋，再加入反應(yīng)體系中，減少抑制物的影響。,兩步擴(kuò)增反應(yīng) Real-time qPCR:,三步擴(kuò)增反應(yīng) Real-time qPCR:,,,3. 提高PCR反應(yīng)特異性的策略,巢式PCR（Nest-PCR）,四種策略,遞減PCR（TouchDown PCR）,熱啟動(dòng)PCR（HotStart PCR）,使用PCR增強(qiáng)劑,策略之一

36、,巢式PCR（Nested-PCR）,,,巢式PCR的使用降低了擴(kuò)增多個(gè)靶位點(diǎn)的可能性，因?yàn)橥嗵滓锒蓟パa(bǔ)的靶序列很少。,巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的靈敏度，并且提高了困難PCR（如5' RACE）的特異性。,,,,,,,,,,First roundprimers,,,,,,,,,,First roundPCR,,,,,,,,Second roundprimers,,,,,,,,,,Second r

37、oundPCR,,,Gene of interest,Nested PCR: to increase specificity,策略之二,遞減PCR（TouchDown PCR）,遞減PCR通過在PCR的前幾個(gè)循環(huán)使用嚴(yán)謹(jǐn)?shù)耐嘶饤l件提高特異性。循環(huán)設(shè)在比估算的Tm高大約5℃的退火溫度下開始，然后每個(gè)循環(huán)降低1-2℃,直到退火溫度低于Tm 5℃。,特異性最高的目的模板會(huì)被優(yōu)先擴(kuò)增，這些產(chǎn)物在隨后的循環(huán)中繼續(xù)擴(kuò)增占據(jù)優(yōu)勢(shì)。,遞減PCR對(duì)于那

38、些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更為有用，如AFLP、DNA指紋分析等。,策略之三,熱啟動(dòng)PCR （HotStart PCR）,熱啟動(dòng)主要是通過抑制一種基本成分延遲DNA合成，直到PCR 儀達(dá)到變性溫度；,現(xiàn)在有很多公司都有HotStart Taq酶出售，該酶具有熱啟動(dòng)的性能，使用簡(jiǎn)單方便，適合于高通量應(yīng)用；,熱啟動(dòng)PCR是除了好的引物設(shè)計(jì)之外，提高PCR特異性最重要的方法之一。,策略之四,使用PCR增強(qiáng)劑,甲酰胺，DMSO，甘油

39、，甜菜堿等都可充當(dāng)PCR的增強(qiáng)劑。,其可能的機(jī)理是降低熔解溫度，從而有助于引物退火并輔助DNA聚合酶延伸通過二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)。,增強(qiáng)劑濃度要適當(dāng),4. PCR 常見問題及分析,Denaturation TempAnnealing TempExtension TempTimeNumber of CyclesReaction Volume“Odd” Protocols,PCR Cycling Parameters,WaterBuff

40、erDNA templatePrimersNucleotidesMg++ ions DNA PolymeraseExtras,Reaction Components,Important! Basic Experimental Design,A well-designed experiment can keep you from ever getting into trouble!A poorly-designed e

41、xperiment is asking for problems!!!!,Main point: Always use CONTROLSPositive controlSo you’ll know what a successful result looks like.Negative controlLets you know if you have contamination.,Experimental Design: Con

42、trols,No positive or negative controls…What does this result mean??,,Only a positive control…How do we know the result isn’t due to contamination?,,Both positive and negative controls…Results can be interpreted withco

43、nfidence.,,U,U,+,U,-,+,PCR常見問題之一,無擴(kuò)增產(chǎn)物（假陰性）,模板:含有抑制物，含量低Buffer對(duì)樣品不合適引物設(shè)計(jì)不當(dāng)或者發(fā)生降解反應(yīng)條件：退火溫度太高，延伸時(shí)間太短,原因,對(duì)策,純化模板或者使用試劑盒提取模板DNA或加大模板的用量更換Buffer或調(diào)整濃度重新設(shè)計(jì)引物（避免鏈間二聚體和鏈內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu)）或者換一管新引物降低退火溫度、延長(zhǎng)延伸時(shí)間,現(xiàn)象：正對(duì)照有條帶，而樣品則無；,PCR常見問題之

44、二,,非特異性擴(kuò)增,現(xiàn)象：PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。,PCR常見問題之二,,引物特異性差模板或引物濃度過高酶量過多Mg2+濃度偏高退火溫度偏低循環(huán)次數(shù)過多,原因,對(duì)策,重新設(shè)計(jì)引物或者使用巢式PCR適當(dāng)降低模板或引物濃度適當(dāng)減少酶量降低鎂離子濃度適當(dāng)提高退火溫度或使用二階段溫度法減少循環(huán)次數(shù),非特異性擴(kuò)增,PCR常見問題之三,,拖尾,現(xiàn)象：產(chǎn)物在凝

45、膠上呈Smear狀態(tài)。,,M 1 2,PCR常見問題之三,,模板不純Buffer不合適退火溫度偏低酶量過多dNTP、Mg2+濃度偏高循環(huán)次數(shù)過多,原因,對(duì)策,純化模板更換Buffer適當(dāng)提高退火溫度適量用酶適當(dāng)降低dNTP和鎂離子的濃度減少循環(huán)次數(shù),拖尾,PCR常見問題之四,假陽(yáng)性（篩選轉(zhuǎn)基因、檢測(cè)基因表達(dá)情況),原因：靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染,現(xiàn)象：空白對(duì)照出現(xiàn)目的擴(kuò)

46、增產(chǎn)物,對(duì)策：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外；除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及加樣槍頭等均應(yīng)一次性使用。各種試劑最好先進(jìn)行分裝，然后低溫貯存。,PCR常見問題之五--------引物二聚體,5. 分子檢測(cè)的靶標(biāo)基因,Purvis and Hector, 2000, Nature,,,昆蟲,菌物,昆蟲和菌物的物種豐富度,The mitochondrial cytochro

47、me oxidase c subunit I (COI) gene is one of the most popular markers for population genetic and phylogeographic studies across the animal kingdom.,,,HCOR 2198*,Ag1859R°,mtDNA Genome,The order of genes on the mitocho

48、ndrial genome,Relatively well studied at the biochemical level Size and structure conserved across all aerobic organisms Mix of variable and conserved regions Largest of the three CO subunits Broad spectrum of subst

49、itutional rates,菌物常用的靶標(biāo)基因,核糖體基因包括5S、5.8S、18S、28S在內(nèi)的4個(gè)rDNA基因，是細(xì)胞核內(nèi)染色體上的多拷貝、中度重復(fù)序列。編碼18S、5. 8S和28S的rDNA作為1個(gè)轉(zhuǎn)錄單 元，以中等重復(fù)的串聯(lián)形式存在于染色體 上。,ITS作為DNA條形碼的優(yōu)點(diǎn),（1）ITS兩側(cè)序列保守便于設(shè)計(jì)通用引物，可廣泛應(yīng)用于 PCR 擴(kuò)增；（2）ITS的高重復(fù)度有利于從微量DNA 樣品中進(jìn)行檢測(cè)（3）ITS可

50、應(yīng)用于同屬近緣種及種內(nèi)的進(jìn)化關(guān)系研究；,IGS（Intergenic spacer，核糖體基因內(nèi)間隔區(qū)）序列：分開每個(gè)重復(fù)序列的DNA片段。相對(duì)于ITS 區(qū)，IGS是一個(gè)高變區(qū),它們常用于屬內(nèi)種間比較或種內(nèi)群體比較。,beta tubulinActinRNA polymerase II large subunit, RPB1Translation elongation factor 1-αYpt1… ….,菌物常用的靶標(biāo)基

51、因,List of primers reported for the identification and detection of Phytophthora species known to threaten forests and other natural ecosystems.,線粒體DNA是真核生物細(xì)胞核外一種呈環(huán)狀的小分子雙鏈DNA，單拷貝，不含基因間隔區(qū)和內(nèi)含子，進(jìn)化歷史簡(jiǎn)單明了，酶切位點(diǎn)少，易于分析。由于mtDNA的

52、分子進(jìn)化速度比細(xì)胞核DNA快，所以mtDNA分子的分析物種種內(nèi)和種間的分類靈敏度高，應(yīng)用PCR等分子生物學(xué)技術(shù)可將分類單位精確到種以下，可以用來對(duì)種、變種、個(gè)體菌株及雜交種進(jìn)行檢測(cè)。,線粒體DNA （mitochondrial DNA， mtDNA,思考題：1. 核酸沉淀常用的有機(jī)溶劑，他們的優(yōu)缺點(diǎn)是什么。2. 核酸提取不純的原因是什么，如何改進(jìn)。3. 基因組提取過程中降解的原因及改進(jìn)。4. 1個(gè)PCR循環(huán)是有哪幾步組成，分別是

53、什么。5. 不同PCR的類型，6. 多重PCR如何進(jìn)行，有什么優(yōu)缺點(diǎn)7. 定量PCR、擴(kuò)增曲線、熒光閾值、Ct值、標(biāo)準(zhǔn)曲線、融解曲線、絕對(duì)定量、相對(duì)定量、-ΔΔCt、雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法8. SYBR Green 法和TaqMan法9. Q2:Ct值出現(xiàn)過晚（Ct＞38）、陰性對(duì)照也出現(xiàn)明顯的起飛、熔解曲線不止一個(gè)主峰的原因。10. TouchDown PCR是什么。11假陰性、非特異性擴(kuò)增、拖尾、假陽(yáng)性和引物二聚體出現(xiàn)的原因是什

54、么，如何改進(jìn)。12. COI、ITS、IGS指的是，有什么價(jià)值,第4節(jié)核酸雜交技術(shù),核酸雜交技術(shù),核酸雜交（hybridization）是兩條互補(bǔ)的核苷酸單鏈在特定的條件下退火形成異質(zhì)雙鏈的過程。核酸雜交技術(shù)是建立在以堿基互補(bǔ)為基礎(chǔ)的、以雙鏈核酸分子在特定條件下的變性和復(fù)性為手段的，對(duì)核酸分子進(jìn)行定性和定量檢測(cè)的技術(shù)。,核酸雜交既可以是DNA與DNA鏈、RNA與RNA鏈之間的雜交，又可以是DNA與RNA鏈之間的雜交。,核酸雜交可進(jìn)行

55、染色體圖譜分析，測(cè)定特異DNA序列的拷貝數(shù)（甚至可檢測(cè)到哺乳動(dòng)物基因組中的單拷貝基因），鑒定與疾病有關(guān)的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記，進(jìn)行基因克隆的篩選，檢測(cè)不同濃度的DNA，鑒別特異基因的表達(dá)部位，,核酸探針,含有標(biāo)記物的與待檢測(cè)核酸片段具有高度同源性的特定核酸片段，可以對(duì)待檢測(cè)核酸進(jìn)行定性、定量和定位的工具。,根據(jù)核酸探針分子性質(zhì)的不同可分為DNA探針和RNA探針；根據(jù)核酸探針來源的不同又分為基因組DNA探針、人工合成的寡核苷酸探針和

56、cDNA探針。,探針的標(biāo)記,放射性標(biāo)記物32P、3H、35S、14C、125I、或131I 非放射性標(biāo)記物 地高辛(Digoxigenin, Dig)；熒光素(fluorecein)標(biāo)記，如羅丹明或FITC；生物素 ；,Southern blotNorthern blot,斑點(diǎn)雜交 斑點(diǎn)雜交是分子雜交中最簡(jiǎn)單的一種，直接將 DNA 或 RNA 分子以斑點(diǎn)的形式固定在濾膜上，然后進(jìn)行分子雜交。,當(dāng)核酸分子的斑點(diǎn)面積變得

57、更小，在單位面積濾膜上處理的樣品數(shù)量就更多，當(dāng)檢測(cè)的靈敏度進(jìn)一步提高后，就發(fā)展成 DNA 芯片。基因芯片（Gene Chip）通常指DNA芯片，其基本原理是將指大量寡核苷酸分子固定于支持物上，然后與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，通過檢測(cè)雜交信號(hào)的強(qiáng)弱進(jìn)而判斷樣品中靶分子的數(shù)量。基因芯片的概念現(xiàn)已泛化到生物芯片（biochip）、微陣列（Microarray）、DNA芯片（DNA chip），甚至蛋白芯片。,基因芯片集成了探針固相原位合成技術(shù)、

58、照相平板印刷技術(shù)、高分子合成技術(shù)、精密控制技術(shù)和激光共聚焦顯微技術(shù)，使得合成、固定高密度的數(shù)以萬計(jì)的探針分子以及對(duì)雜交信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)、靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)分析變得切實(shí)可行。開發(fā)基因芯片的公司主要有：Affymetrix，Nanogen，BioRobotics，Caliper等。,基因芯片發(fā)展歷史,Southern & Northern Blot,,,Dot Blot,Macroarray,Microarray,,,,,應(yīng)用領(lǐng)域

59、一、科研領(lǐng)域基因表達(dá)檢測(cè)、突變檢測(cè)、基因組多態(tài)性分析和基因文庫(kù)作圖以及雜交測(cè)序等方面。 二、生物制藥領(lǐng)域篩選新藥等 三、診斷病原體診斷，如細(xì)菌和病毒鑒定、耐藥基因的鑒定。在疾病診斷方面，優(yōu)生方面等,基因芯片研制的總體藍(lán)圖,表達(dá)芯片的制備檢測(cè)流程,基因芯片技術(shù)以其具有高通量、快速靈敏、樣品用量少等顯著特點(diǎn)在病原菌檢測(cè)中發(fā)揮著越來越重要的作用。,IF≈4.0,IF≈2.8,PCR based methods,DNA Finger

60、printing,RFLP = Restriction Fragment Length PolymorphismRegular fingerprinting analyses phenotypic traits.DNA fingerprinting analyses genotypic traits.DNA fingerprinting (DNA typing) is used to characterize biologica

61、l samples e.g. -> In legal proceedings to identify suspects and clear others. -> Paternity testing,Very simple; dependent on mutation within recognition site of restriction enzyme Former used with southern blot

62、experimentsEven as many restriction enzymes are known, some mutation sites do not correspond to any,-> Rare endonucleases are difficult to work with, and often of a poor quality,Restriction fragment length polymorphi

63、sm (RFLP),Restriction fragment length polymorphism (RFLP),Modified method:Diagnostic restriction site introduced artificially by purposedly ismatched PCR primer,140,PCR based methods,Random Amplified Polymorphic DNA (

64、RAPD),RAPD is often used to show relatedness among DNA populations.In this procedure arbitrary (random) primers are used during PCR to produce a fingerprint of the DNA.A single primer is used which must anneal in 2 pla

65、ces on the DNA template and region between the primers will be amplified.,The primers (8-10nt) are likely to anneal in many places on the template DNA and will produce a variety of sizes of amplified products.Amplified

66、products are separated by agarose gel electrophoresis and visualized.If the samples have similar genetic make up then the pattern of bands on the gel will be similar and vice versa.This procedure is widely used to diff