用核酸探針和分子斑點(diǎn)雜交技術(shù)檢測(cè)家禽病毒的核酸.pdf

1、在雞群中同一個(gè)體同時(shí)存在不同的病毒感染是普遍現(xiàn)象，因此如何能同時(shí)檢測(cè)同一份病料中不同的病毒，對(duì)于疫病的鑒別診斷和流行病學(xué)研究甚為重要。本研究試圖運(yùn)用分子斑點(diǎn)雜交技術(shù)，同時(shí)用不同的病毒核酸探針檢測(cè)同一批病料中的不同病毒，它們分別是禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(REV)、馬立克氏病病毒(MDV)、雞傳染性貧血病毒(CAV)、呼腸孤病毒(ARV)和傳染性支氣管炎病毒(IBV)。 本實(shí)驗(yàn)從泰安某市場(chǎng)采集地方品種雞的脾臟200份、羽毛囊200

2、份；從萊陽(yáng)某商品肉雞場(chǎng)采集脾臟200份、雞胚100枚，共計(jì)700份樣品。用REV LTR序列和pol基因標(biāo)記的核酸探針、MDV PP38基因標(biāo)記的核酸探針、CAV VP1基因標(biāo)記的核酸探針、ARV 63基因標(biāo)記的核酸探針、IBV N基因標(biāo)記的核酸探針，分別檢測(cè)REV、MDV、CAV、ARV和IBV。檢測(cè)結(jié)果如下： 200份地方品種雞脾臟樣品中MDV、CAV、ARV、IBV和REV的檢測(cè)結(jié)果：MDV陽(yáng)性123份， CAV陽(yáng)性91份

3、，ARV陽(yáng)性21份，IBV陽(yáng)性23份，用REV LTR序列標(biāo)記的核酸探針檢出REV陽(yáng)性194份，用REVpol基因標(biāo)記的核酸探針檢出REV陽(yáng)性10份。 200份地方品種雞脾臟樣品中MDV、CAV、ARV、mV和REV的共感染情況：MDV和REV共感染為7份，MDV和CAV共感染為60份，MDV和ARV共感染為17份，MDV和IBV共感染為10份，CAV和REV共感染為9份，CAV和ARV共感染為14份，CAV和IBV共感染為13

4、份，MDV、CAV和REV的三重感染為6份，MDV、CAV和ARV的三重感染為13份，MDV、CAV和IBV的三重感染為7份(REV的感染數(shù)據(jù)來(lái)自pol基因標(biāo)記的核酸探針檢測(cè)結(jié)果)。 200份地方品種雞羽毛囊樣品中MDV、CAV、ARV、IBV和REV的檢測(cè)結(jié)果：CAV、ARV和IBV全部陰性，MDV陽(yáng)性121份，用REV LTR序列和pol基因標(biāo)記的核酸探針檢測(cè)REV全部陰性。 200份商品肉雞脾臟樣品中MDV、CAV

5、、ARV、IBV和REV的檢測(cè)結(jié)果：MDV陽(yáng)性177份， CAV陽(yáng)性143份， ARV和IBV全部陰性，用REV LTR序列標(biāo)記的核酸探針檢出REV陽(yáng)性103份，用REV pol基因標(biāo)記的核酸探針檢測(cè)REV全部陰性。 200份商品肉雞脾臟樣品中MDV、CAV、ARV、IBV和REV的共感染情況：MDV和CAV的共感染為137份(REV的感染數(shù)據(jù)來(lái)自pol基因標(biāo)記的核酸探針檢測(cè)結(jié)果)。 100份萊陽(yáng)雞胚樣品中MDV、CAV、ARV

6、、IBV和REV的檢測(cè)結(jié)果：MDV、ARV和IBV全部陰性，CAV陽(yáng)性100份，用REV LTR序列和00l基因標(biāo)記的核酸探針檢測(cè)REV全部陰性。 在對(duì)200份地方品種雞和200份商品肉雞的脾臟樣品用REV LTR序列和pol基因標(biāo)記的核酸探針同時(shí)檢測(cè)REV時(shí)，兩種核酸探針對(duì)REV的檢出率差異極大：在200份地方品種雞脾臟樣品中，用REV LTR序列標(biāo)記的核酸探針檢出REV陽(yáng)性194份，而用REV pol基因標(biāo)記的核酸探針檢出R

7、EV陽(yáng)性僅為10份，并且這10份陽(yáng)性樣品包含在上面的194份陽(yáng)性樣品中；在200份商品肉雞脾臟樣品中，用REV LTR序列標(biāo)記的核酸探針檢出REV陽(yáng)性103份，而用REV pol基因標(biāo)記的核酸探針檢測(cè)REV全部陰性。對(duì)比結(jié)果表明，用REV LTR序列標(biāo)記的核酸探針，對(duì)REV的檢測(cè)結(jié)果大部分是非特異性的，可能是由LTR序列整合到其它病毒或宿主基因組造成的REV假陽(yáng)性，因此在應(yīng)用分子斑點(diǎn)雜交技術(shù)檢測(cè)REV時(shí)，不能選用REV LTR序列標(biāo)記探

8、針，而應(yīng)選擇REV的其它基因標(biāo)記探針，如pol基因，這樣很大程度上可以提高REV檢測(cè)的特異性。 從萊陽(yáng)某種雞場(chǎng)送檢的疑似雞傳染性貧血的病雞骨髓、胸腺和法氏囊中提取組織DNA和RNA，斑點(diǎn)雜交檢測(cè)REV、MDV、CAV、ARV和IBv。檢測(cè)結(jié)果顯示：CAV全部陽(yáng)性，REV、MDV、ARV和IBV全部陰性。以CAV陽(yáng)性組織DNA為模板，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，對(duì)病料中的CAV的VPl基因進(jìn)行了克隆和序列測(cè)定。序列測(cè)定結(jié)果顯示其VPl基因