基于核酸短暫雜交和磁分離技術(shù)的單堿基突變檢測(cè)方法.pdf

1、單核苷酸突變(single-nucleotide mutation，SNM)已被證明與人類的多種疾病相關(guān)，因此開發(fā)可靠的單核苷酸突變檢測(cè)方法對(duì)于分子診斷和個(gè)體化醫(yī)療至關(guān)重要。由于夾心法低成本和檢測(cè)速度快的特點(diǎn)，目前廣泛應(yīng)用于核酸生物標(biāo)志物的檢測(cè)，然而，在室溫下信號(hào)探針的雜交特異性差阻礙了突變體和野生體基因的有效區(qū)分。本研究以磁珠動(dòng)態(tài)夾心法為基礎(chǔ)開發(fā)出一種基于信號(hào)探針與目標(biāo)鏈之間短暫結(jié)合的SNM檢測(cè)方法。這種磁珠動(dòng)態(tài)夾心法(dynamic

2、 sandwich assay，DSA)利用DNA短暫結(jié)合對(duì)單堿基錯(cuò)配敏感的熱力學(xué)特性，能夠在較寬范圍的鹽離子濃度及室溫條件下實(shí)現(xiàn)對(duì)突變體較高的區(qū)分效果。
　　通過(guò)對(duì)磁珠粒子表面DNA雜交的研究，發(fā)現(xiàn)粒子表面高密度負(fù)電荷可以選擇性地削弱野生型雙鏈（單堿基錯(cuò)配雙鏈）的穩(wěn)定性而對(duì)突變型雙鏈沒(méi)有明顯影響，因此本研究中使用的磁珠不僅可以作為一種分離工具，還可以提高SNM的選擇性;靈活的信號(hào)探針設(shè)計(jì)和簡(jiǎn)單的磁分離操作使得該方法可以進(jìn)行多種模

3、式的下游分析，包括比色法檢測(cè)和等溫?cái)U(kuò)增等。對(duì)于比色檢測(cè)來(lái)說(shuō)，突變體存在下，ABTS-氧化產(chǎn)物呈現(xiàn)典型綠色并在410nm處有較強(qiáng)的吸收，而野生型沒(méi)有明顯變化。DSA基于富含G序列探針的檢出限為5nM;對(duì)于等溫?cái)U(kuò)增來(lái)說(shuō)，5amol突變體在1h內(nèi)便能呈現(xiàn)特征擴(kuò)增曲線，而野生型不顯示。DSA基于等溫指數(shù)擴(kuò)增的檢出限為0.1fM;利用該方法對(duì)癌細(xì)胞提取基因組DNA中的BRAF D594G(c.1781A＞G)及BRAF V600E(c.1799T