基于酶催化沉積的單堿基突變檢測(cè)及免疫分析.pdf_第1頁(yè)
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1、人類的許多遺傳性疾病都是由于基因的變異引起的,其中尤以單堿基的突變,即單堿基多態(tài)性最為普遍。實(shí)現(xiàn)對(duì)這些基因單堿基突變的早期、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快速的確認(rèn),對(duì)于人類相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)理研究及早期治療具有非常重要的意義。目前,有關(guān)單堿基突變的檢測(cè)方法已有許多報(bào)道。而這些傳統(tǒng)的方法普遍操作繁瑣費(fèi)時(shí)、不易定量、儀器昂貴、而且對(duì)工作人員要求較高的專業(yè)技能,因此僅能在少數(shù)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。開發(fā)一些簡(jiǎn)便、廉價(jià)、精確且易于臨床推廣的方法是一件很有價(jià)值的工作。此外,由

2、于電化學(xué)生物傳感器具有制造簡(jiǎn)單、靈敏度高、價(jià)格低廉而被廣泛研究,并已在生物檢測(cè)中逐步得到了應(yīng)用。 本文分別研究了運(yùn)用DNA連接酶、鏈親和素堿性磷酸酶來檢測(cè)基因的單堿基突變、基因分型及人免疫球蛋白?,F(xiàn)將所作的工作簡(jiǎn)單的敘述一下: 第一部分:結(jié)合了DNA連接酶的高忠實(shí)性以及鏈親和素堿性磷酸酶的催化作用對(duì)K-Ras癌基因的單堿基突變進(jìn)行定性及定量分析。金電極表面固定的探針和待檢測(cè)的突變鏈?zhǔn)腔パa(bǔ)的,在連接酶、突變目標(biāo)鏈以及5’-

3、磷酸化的連接探針存在下,表面固定的探針會(huì)和連接探針連接起來。在90℃下進(jìn)行熱處理變性。接著,生物素化的檢測(cè)探針和連接產(chǎn)物進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)反應(yīng)。再接著加入鏈親和素化的堿性磷酸酶,通過生物素和鏈親和素的特異性識(shí)別作用,鏈親和素化的堿性磷酸酶結(jié)合到了電極表面。在堿性磷酸酶的作用下,非還原性的抗壞血酸2-磷酸(AA-P)轉(zhuǎn)化成抗壞血酸(AA)。溶液中的銀離子在抗壞血酸的作用下,被還原成銀,從而使得銀顆粒沉積在電極表面。線性掃描伏安法被用來檢測(cè)電極表

4、面沉積的銀。這種方法已經(jīng)成功的用于檢測(cè)編碼K-Ras癌基因的第12位密碼子的單堿基突變,其檢測(cè)下限為80 fM。 第二部分:基于第一部分的原理,結(jié)合DNA連接酶和堿性磷酸酶,測(cè)定多藥耐藥基因MDRl的基因分型。多藥耐藥基因MDR1的基因分型有3種,分別為C-C型、C-T型和T-T型。對(duì)基因分型的檢測(cè)是在兩個(gè)金電極上進(jìn)行的,這兩個(gè)金電極分別通過自組裝巰基DNA而固定上探針DNA,接著加入待測(cè)的目標(biāo)鏈,如果目標(biāo)鏈和探針DNA互相匹配

5、,則能產(chǎn)生響應(yīng)。反之,則不能。通過兩個(gè)電極的最終反應(yīng)結(jié)果,我們可以得知具體的基因分型。 第三部分:發(fā)展了一種生物沉積銅并以鉑催化氫還原伏安法進(jìn)行檢測(cè)的高靈敏電化學(xué)免疫分析新方法。該方法采用夾心免疫分析模式,實(shí)現(xiàn)了人免疫球蛋白(H IgG)的測(cè)定。首先在聚苯乙烯微孔板中固定羊抗H IgG捕獲抗體,H IgG捕獲后,堿性磷酸酶標(biāo)記的H IgG抗體通過與H IgG形成夾心復(fù)合物而結(jié)合在微孔板上。結(jié)合的堿性磷酸酶催化抗壞血酸磷酸酯底物水

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