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文檔簡介
1、本研究利用定點突變和隨機突變的技術(shù)手段,對擴展青霉脂肪酶(Penicilliumexpansumlipase,PEL)進行了最適作用溫度、高溫穩(wěn)定性及低溫適應性的蛋白質(zhì)工程改造,結(jié)果如下:1、PEL基因的定點突變采用重疊延伸PCR的方法對PEL基因進行了E83V、T88P、K226R、E54P的定點突變,利用大引物PCR的方法進行了E214P的突變。突變基因在畢赤酵母GS115中表達,對突變體的最適作用溫度和熱穩(wěn)定性的研究結(jié)果表明:突變
2、體PEL-E83V-GS的最適作用溫度提高了5.0℃,其比活約為野生型的2倍,熱穩(wěn)定性略有下降。說明了突變后疏水性較強的氨基酸Val可能增加了酶分子的表面疏水性,從而提高酶分子的疏水性包裝效率;突變體PEL-E214P-GS的最適作用溫度比野生型提高了7.5℃,熱穩(wěn)定性也提高了2.4℃,體現(xiàn)了Pro對熱穩(wěn)定性的特殊貢獻;突變體PEL-T88P-GS的最適作用溫度比野生型提高了2.5℃,但熱穩(wěn)定性無明顯變化,而點E54P突變后則完全失去酶
3、活;突變體PEL-K226R-GS的最適作用溫度比野生型提高了5.0℃,但熱穩(wěn)定性和酶活有所下降。說明了Arg替換Lys后,脂肪酶與底物可能形成了額外的氫鍵,但同時也可能形成了空間位阻。2、PEL基因的隨機突變用易錯PCR的定向進化技術(shù)手段對PEL基因進行了隨機突變,PCR產(chǎn)物與載體pPIC3.5K構(gòu)建重組表達質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化大腸桿菌構(gòu)建突變文庫。突變文庫的混合質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化畢赤酵母,通過對7000個重組菌的篩選,第一輪篩選出60個克隆子,然后進
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